红三叶草异黄酮对高糖高脂诱导脂肪肝大鼠脂质过氧化及肝功能的影响

宁鸿珍，关维俊，刘英莉，李清钊，刘海燕，唐永梅，周瑞华

（河北联合大学公共卫生学院河北省职业安全卫生重点实验室，河北唐山063000）

红三叶草异黄酮对高糖高脂诱导脂肪肝大鼠脂质过氧化及肝功能的影响

宁鸿珍，关维俊，刘英莉，李清钊，刘海燕，唐永梅，周瑞华

（河北联合大学公共卫生学院河北省职业安全卫生重点实验室，河北唐山063000）

观察红三叶草异黄酮对高糖高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠脂质过氧化及肝功能的影响。雄性SD大鼠54只，饲养一周后，随机抽取12只大鼠为对照组，喂普通饲料。其余为造模组，脂肪乳灌胃，同时给予18%的蔗糖溶液。连续4周后，随机处死2只对照组大鼠和2只造模组大鼠，做肝脏病理切片，镜下见脂肪变，表明造模成功。然后将造模组大鼠按体重随机分为4组（每组10只）：分别为模型组、红三叶草异黄酮低、中、高剂量组（75、150、300 mg/kg灌胃），共计12周。实验结束处死大鼠，收集血清和肝组织，检测血清及肝组织中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、游离脂肪酸（FFA）、超氧化物歧化酶活性（SOD）、丙二醛（MDA）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的活性或含量。与模型组比较，红三叶草异黄酮中、高剂量组能明显降低血清及肝脏中TC、TG、LDL-C及FFA的含量，升高血清及肝脏中HDL-C的含量，血清及肝组织SOD酶活性升高，MDA含量降低（P＜0.05）；肝功能指标血清ALT及AST（145.88±34.28）的含量明显低于模型组（P＜0.05）。一定剂量的红三叶草异黄酮具有调节脂质代谢及减少高糖高脂膳食导致的氧化损伤作用，肝细胞损伤减轻，肝功能改善，对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能具有一定的保护作用。

红三叶草异黄酮；非酒精性脂肪肝；肝功能；脂质过氧化

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的肝损伤因素所导致的脂肪肝，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要病理特征的疾病。其疾病谱随病程的进展而表现不一，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepalitis，NASH）、肝硬化甚至肝细胞癌［1］。红三叶草为豆科三叶草属多年生牧草，自上世纪40年代以来，对于红三叶草的营养和保健作用日益受到重视。本实验通过用高糖高脂饮食诱导NAFLD大鼠动物模型，从脂质代谢、氧化代谢方面探讨红三叶草异黄酮对非酒精性脂肪性肝抗氧化能力和肝功能的影响，为红三叶草的开发应用提供一些理论参考。

1　材料与方法

1.1主要仪器与受试物

红三叶草异黄酮为棕黄色粉末，纯度80%（西安小草植物科技有限公司）。日立7600-020型全自动生化分析仪（日本Roche公司）；VERSAmax酶标仪（美国Molecular Devices公司）。脂肪乳制剂及18%蔗糖溶液自制（河北省职业安全卫生重点实验室）。

1.2实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠54只，体重200g～220g（天津市山川红实验动物科技有限公司），合格证号：SCXK（津）2009-0001，基础饲料（河北联合大学动物中心）。

1.3分组与处理

雄性SD大鼠，饲养1周后，随机分为对照组（n= 12）和造膜组（n=42），对照组给予基础饲料，造膜组给予脂肪乳灌胃，同时给予18%的蔗糖溶液，4周后，从造膜组和对照组随机抽取2只大鼠做肝脏病理切片，镜下见脂肪变，表明造模成功。然后将40只造膜组大鼠按体重随机分为4组，模型组、红三叶草低、中、高剂量组。对照组与模型组给予生理盐水；红三叶草低、中、高剂量组分别灌胃给予75、150和300 mg/kg红三叶草异黄酮。于末次给受试物后，禁食不禁水12 h，心脏采血，离心分离血清，处死大鼠，立即取大鼠肝脏制匀浆用EP管封存置于-80℃保存，用于肝脏指标的检测。

1.4指标与方法

用全自动生化分析仪检测肝组织和血清LDL-C、TC、TG、HDL-C。SOD测定用黄嘌呤氧化酶法；MDA测定用硫代巴比妥酸法。

1.5统计分析

所有数据均以x±s表示，采用Microsoft Excel 2003建立数据库，SPSS 18.0统计软件进行方差分析，两两组间比较用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1红三叶草异黄酮对非酒精性脂肪肝大鼠脂质水平的影响

红三叶草异黄酮对非酒精性脂肪肝大鼠脂质水平的影响见表1、表2。

表1　各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA水平的比较（mmol/L，x±s）Table 1Comparison of level in serum of TC，TG，LDL-C，HDL-C and FFA in each group of rats（mmol/L，x±s）

表2　各组大鼠肝组织中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA水平比较（mmol/L，x±s）Table 2Comparison of level in liver tissues of TC，TG，LDL-C，HDL-C and FFA in each group of rats（mmol/L，x±s）

由表1、2结果可见，与对照组比较，模型组大鼠血清及肝脏中TC、TG、LDL-C、FFA含量均升高，HDLC含量降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明大鼠患非酒精性脂肪肝后脂代谢发生紊乱；补充红三叶草异黄酮后，上述情况明显改善；与模型组比较，红三叶草异黄酮中、高剂量组大鼠血清及肝脏中TC、TG、 LDL-C含量降低（P＜0.05），HDL-C含量升高，说明一定剂量的红三叶草异黄酮对脂质水平有调节作用。2.2红三叶草异黄酮对非酒精性脂肪肝大鼠抗氧化作用的影响

红三叶草异黄酮对非酒精性脂肪肝大鼠抗氧化作用的影响见表3。

表3　各组大鼠肝组织及血清MDA、SOD含量比较（x±s）Table 3Comparison of level in serum and liver tissues of MDA and SOD in each group of rats（x±s）

由表3可见，模型组大鼠肝组织和血清SOD活性均低于对照组，MDA含量高于对照组；而给予红三叶草异黄酮的三个剂量组，其肝组织和血清SOD活性高于模型组，MDA含量低于模型组，以中、高剂量组差异明显（P＜0.05），说明红三叶草异黄酮可以提高机体SOD活性，并可以清除体内氧自由基，降低MDA的含量。

2.3红三叶草异黄酮对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影响

红三叶草异黄酮对非酒精性脂肪肝大鼠肝功能的影响见表4。

表4　各组大鼠血清ALT及AST水平比较（U/L，x±s）Table 4Comparison of level in serum of ALT and AST in each group of rats（U/L，x±s）

结果如表4所示，与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，红三叶草各剂量组大鼠血清AST和ALT含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

非酒精性脂肪肝病为获得性代谢应激性肝脏损伤，系肥胖、高脂血症及其相关代谢综合征累计肝脏的常见病理表现［2］。其发病机制复杂，多种因素与其发生发展相关，目前认为主要有炎症、氧自由基、脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗、腹型肥胖、脂肪细胞因子、铁超载等因素［3-7］。从本实验结果可看出，高脂、高糖诱导的NAFLD大鼠，其肝脏和血清TC、TG、FFA及MDA含量高于正常对照组，SOD活性低于正常对照组，说明血脂升高时脂质过氧化作用增强，过氧化产物增加，而抗氧化酶活性降低，给予红三叶草异黄酮后，与模型组比较血脂水平降低、抗氧化酶活性增加，同时降低过氧化脂质产物MDA的含量，血清模型组SOD活性和MDA含量分别为6.05 U/mg蛋白和10.51 nmol/mL，而红三叶草异黄酮中高剂量组SOD活性分别为8.44 U/mg和12.97 U/mg，MDA含量分别为6.97和4.48 nmol/mL。脂质沉积和脂质过氧化是NAFLD的主要发生、发展过程，由此可以认为，红三叶草异黄酮对NAFLD具有一定的防治作用。高剂量红三叶草异黄酮还可降低肝脏和血清FFA。由此可见，红三叶草异黄酮可通过调节脂质、增加抗氧化能力来改善NAFLD疾病状态。

ALT和AST是目前较常用的反映肝脏功能的指标，本研究结果显示，红三叶草中、高剂量组大鼠血清中ALT（65.62、61.12 U/L）和AST（145.88、145.50 U/L）水平低于模型组（ALT为82.00 U/L、AST为187.38 U/L），差异具有统计学意义。提示一定剂量的红三叶草异黄酮可以降低ALT和AST，对肝功能具有一定的保护作用。

综上所述，高脂饮食可诱导肝脏脂肪沉积，引起脂质过氧化，造成肝细胞的损伤［8］。而红三叶草异黄酮可降低肝脏脂肪合成，促进脂肪分解反应和脂肪酸的氧化，进而改善NAFLD疾病状态。

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［8］秦艳，张晾，潘杰．高脂饮食对非酒精性脂肪肝影响机制研究进展［J］.实用肝脏病杂志，2010，13（1）：72-74

Effect of Red Clover Isoflavones on Liver Function and Inflammatory Response of Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rats

NING Hong-zhen，GUAN Wei-jun，LIU Ying-li，LI Qing-zhao，LIU Hai-yan，TANG Yong-mei，ZHOU Rui-hua
（School of Public Health，Hebei United University，Coal Health and Safety Lab of Hebei Province，Tangshan 063000，Hebei，China）

Observation of Red Clover Isoflavones on liver function and inflammatory response of nonalcoholic fatty liver disease in rats.After one week feeding in laboratory，12 out of 54 male SD rats were randomly chosen as the normal control group and fed with normal diet.The rest were made as modules，gavage feeding with fat emulsion and 18%sucrose solution.Two rats from normal control group and two from module were killed randomly after 4 weeks.Liver biopsy showed the module formation was successful.Then we randomly divided module into 4 groups（n=10）according to weight：Nonalcoholic fatty liver diseases（NAFLD）model control group，high-dose，medium-doseandlow-doseRedCloverIsoflavonestreatmentgroup（75，150，and300mg/kg），respectively.The experiment period lasted 12 weeks.At the end of experiment，rats were killed to collect serum and liver tissues.Then we detected the activity and content of Aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low density lipoprotein cholesterol（LDLC），high density lipoprotein cholesterol（HDL-C），malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）and free fatty acids（FFA）.Compared with model group，the middle-dose group and the high-dose group could significantly decrease TC，TG，LDL-Cand FFA levels in serum and liver tissues and increase HDL-C levels.Compared with the model group，the middle-dose group and the high-dose group of red clover isoflavones could decrease MDA levels and improve SOD activity in serum，and the differences were statistically significant（p＜0.05）.The levels of ALT and AST（145.88±34.28）in middle and high dose group were lower than control group（p＜0.05）.Moderate dose of Red Clover soflavones could regulate lipid metabolism and reduce oxidative damage caused by high sugar and fat diet.Besides，the injury of liver cells was relieved and liver function was improved.For rats with nonalcoholic fatty liver disease，Red Clover Isoflavones had some certain protective effect on their.

Red Clover Isoflavones；non-alcoholic fatty liver f disease；liver unction；inflammatory response

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.005

2014-10-13

宁鸿珍（1959—），女（汉），教授，学士，主要从事食品卫生及营养保健品研发。