浒苔多糖脱蛋白工艺的考察

唐志红，王艺，马红婷，温少红，秦松，*

（1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005；2.中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台264003）

浒苔多糖脱蛋白工艺的考察

唐志红1，王艺2，马红婷1，温少红1，秦松2，*

（1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005；2.中国科学院烟台海岸带研究所，山东烟台264003）

研究浒苔多糖的脱蛋白方法与工艺。以蛋白脱除率和多糖损失率作为为指标比较三氯乙酸（TCA）法、Sevag法、酶法及酶-Sevag法脱蛋白的效果。结果表明：酶-Sevag法脱蛋白效果较好，其最佳工艺条件为：酶用量3%，酶解时间3 h，酶解温度45℃，pH 5.0，Sevag法脱蛋白次数2次，在此条件下，蛋白质脱除率和多糖损失率分别为89.73%和27.46%。酶-Sevag法是去除浒苔粗多糖中蛋白质较理想的方法，该优化工艺可用于浒苔粗多糖的脱蛋白。

浒苔；多糖；脱蛋白

浒苔（Enteromorpha prolifera）是一种较为常见的大型绿藻，俗称苔菜、苔条等，具有重要的食用和药用价值。浒苔中含有丰富的糖类、粗纤维、蛋白质及矿物质，同时还含有维生素和脂肪［1］。其中所含的水溶性多糖具有较强的生物学活性，具有抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化及增强免疫力等药理活性，有着重要的开发价值和广阔的应用空间［2-6］。目前对浒苔多糖的提取多采用热水浸提法，而用热水提取的多糖，常含有较多的蛋白质，因此，尽可能多地去除蛋白质而保留多糖成为多糖纯化的一个重要环节，同时也是提高产品生物活性的有效方法［7］。本实验以多糖损失率和蛋白质去除率为考察指标，对浒苔多糖的脱蛋白方法进行了考察。

1材料与方法

1.1材料与试剂

浒苔：购于山东青岛；木瓜蛋白酶：郑州康源化工产品有限公司；无水乙醇、苯酚、三氯乙酸、浓盐酸、氯仿、正丁醇、浓硫酸、葡萄糖等试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

HP-8453紫外可见分光光度计：惠普公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：上海金桥科技仪器厂；LXJ－ⅡB低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；AR-1104电子天平：奥克斯国际贸易上海有限公司。

1.3方法

1.3.1工艺流程

浒苔粉末→热水浸提（80℃浸提3 h，2次）→离心→上清液真空浓缩→乙醇沉淀→沉淀物溶于水→脱蛋白→浒苔多糖

1.3.2多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法［6］，以葡萄糖作标准曲线测定多糖含量。样品中多糖损失率按以下公式计算。

式中：A0为粗多糖溶液中多糖的百分含量；Ax为脱蛋白后多糖溶液中多糖的百分含量。

1.3.3蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝G-250法［8］，以牛血清蛋白作标准曲线测定蛋白质含量。蛋白质脱除率按以下公式计算。

式中：P0为粗多糖溶液中蛋白质的百分含量；PX为脱蛋白后多糖溶液中蛋白质百分含量。

1.3.4脱蛋白

1.3.4.1三氯乙酸（TCA）法脱蛋白［9］

取粗多糖浓缩液稀释50倍，加入质量浓度不等的TCA，混匀，于4℃冰箱静置过夜，4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定多糖和蛋白质的含量。

1.3.4.2Sevag法［10］

在粗多糖溶液中加入0.20倍体积的氯仿和0.04倍体积的正丁醇，反应30min，经离心去除沉淀后，测定上清液中蛋白质含量。将上清液重复以上脱蛋白步骤。

1.3.4.3酶法

在单因素实验的基础上，选取酶用量、时间、温度、pH为主要因素，进行L9（34）正交试验，以蛋白质的脱除率、多糖保留率为考察指标，确定最佳的脱蛋白条件。因素水平见表1。

表1　酶法脱蛋白正交试验因素水平Table 1Factors and levelst in the orthogonal test of enzyme deproteinization

1.3.4.4酶-Sevag法脱蛋白

按照酶法脱蛋白质的最佳条件，称取一定量的木瓜蛋白酶与粗多糖液混匀除蛋白，置于80℃恒温振荡器中振荡使蛋白酶失活，冷却至室温，然后按“1.3.4.2”进行Sevag法处理。

2结果与分析

2.1三氯乙酸（TCA）法

TCA法对浒苔多糖的脱蛋白结果见图1。

图1　三氯乙酸法（TCA）对蛋白脱除率和多糖损失率的影响Fig.1Effect of TCA concentration on protein removal and polysaccharide loss

TCA脱蛋白质量浓度在1 g/100 mL～6 g/100 mL时，蛋白脱除率明显提高，超过6 g/100 mL时，蛋白质脱除率会有所下降。综合多糖损失率和蛋白脱除率分析，确定三氯乙酸最佳质量浓度6 g/100 mL，此时蛋白脱除率62.39%，多糖损失率31.82%。

2.2Sevag法脱蛋白效果

Sevag法脱蛋白质次数对蛋白脱除率和多糖损失率的影响如图2所示。

图2　Sevag法脱蛋白质次数对蛋白脱除率和多糖损失率的影响Fig.2Effect of Sevag deproteinization times on protein removal and polysaccharide loss

随着Sevag法脱蛋白次数的增加，粗多糖溶液中蛋白质的脱除率逐渐增加，经过3次脱蛋白处理之后增加趋势稍减弱，经过3次脱蛋白处理后，蛋白质脱除率为75.80%；随着处理次数的增加，糖液中多糖的损失也增加，5次脱蛋白处理后多糖损失率达43.31%。

2.3酶法脱蛋白

选取酶用量、酶解时间、酶解温度、pH 4个因素，进行L9（34）正交试验，结果见表2。

对试验数据采用综合加权评分法评分，权重系数均为0.5，分别将2项指标的最大数定为100分，其他各组合按下式评分：综合评分=（蛋白质脱除率/78.62）×100×0.5+（1-多糖损失率/1-11.25）×100×0.5。由表2可见，4个因素对脱蛋白的影响程度为：A＞D＞B＞C。最优工艺条件是A2B3C1D2，即酶用量3%，时间3 h，温度45℃，pH5，按照工艺条件A2B3C1D2进一步作验证试验（3次平行试验），蛋白质脱除率平均达82.65%，多糖损失率平均达20.37%。

表2　酶法脱蛋白正交试验结果Table 2Results of orthogonal test for enzyme method deproteinization

2.4酶-Sevag法脱蛋白

酶-Sevag法脱蛋白结果见图3。

图3　酶-Sevag法脱蛋白的效果Fig.3Deproteinization effects of Enzyme-Sevag method

从图3可以看出，当使用酶法优化条件后处理粗多糖溶液后，接着使用Sevag法脱蛋白2次，蛋白脱除率达到最高，之后增加处理次数脱蛋白率没有明显的增加，而多糖损失明显上升。故确定酶-Sevag联合法的最佳工艺为酶用量3%，时间3 h，温度45℃，pH 5，用Sevag法处理2次，蛋白脱除率可达到89.73%，多糖损失率27.46%。

2.54种脱蛋白方法的比较

三氯乙酸（TCA）法、Sevag法、酶法及酶-Sevag法脱蛋白4种方法对浒苔粗多糖的脱蛋白效果见表3。

表3　4种方法脱蛋白的效果Table 3Comparison of different methods of deproteinization

采用TCA法脱蛋白时条件剧烈，其原理是与大分子蛋白质结合成不溶性盐，从而使蛋白沉淀下来，TCA的质量浓度对脱蛋白效率有较大影响，但当蛋白结构较复杂和致密时，TCA难以渗入内部，使蛋白无法完全沉淀，从表3中可看出TCA法的蛋白脱出率最低。采用Sevag法去除蛋白质时，会将少量黏附的多糖一同除去，造成多糖损失，次数越多，损失也会越多，因此Sevag法多糖损失较为严重。酶法是除蛋白较温和且高效的一种方法，有利于保持多糖的活性，但在酶解时产生的多肽会游离于水中，降低酶法的蛋白脱除效率，将酶法与Sevag法结合，由于酶可水解下蛋白质，使结合在多糖上的蛋白游离出来，引起Sevag法的蛋白沉淀率增大，近年研究也表明酶-Sevag联合法脱蛋白效率高，可以大大减少后续Sevag试剂的使用次数，多糖损失率也较单用Sevag法时降低［11］。

3结论

本实验采用蛋白脱除率和多糖损失率为评价指标，对浒苔多糖的脱蛋白方法进行了筛选，比较4种方法对浒苔粗多糖溶液脱蛋白的效果，综合来看，酶-Sevag法效果最好，蛋白质脱除率最高，多糖损失率较低，试剂用量小，样品损耗少。事实上，不论是采用单一的方法还是采用酶-Sevag法，多糖溶液中仍会有少量蛋白质与多糖牢固结合形成了多糖蛋白质复合物，要想获得更纯的多糖制品，还需要经过其他一系列的精制工艺。

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［5］林文庭.浅论浒苔的开发与利用［J］.中国食物与营养，2007（9）：23-25

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［11］刘莉，李泳怡，潘育方.荔枝核多糖脱蛋白工艺考察［J］.中国实验方剂学杂志，2012，23（12）：52-55

Investigation of Deproteinized Technology for Polysaccharide from Enteromorpha Prolifera

TANG Zhi-hong1，WANG Yi2，MA Hong-ting1，WEN Shao-hong1，QIN Song2，*
（1.College of Life Science，Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China；2.Yantai Institute of Coastal Zone Research，Chinese Academy of Sciences，Yantai 264003，Shandong，China）

The method was investigated to remove protein from polysaccharide of Enteromorpha prolifera.-The effect of deproteinization with different methods such as TCA，Sevag，enzyme，and enzyme-Sevag method was evaluated in terms of the ratio of protein removal and polysaccharide loss.The result showed that enzyme-Sevag method was better than others with the higher protein removal.The optimum technological conditions of deproteinization were：enzyme usage 3%，time 3 h，temperature at 45℃，pH5.0，and Sevag deproteinization 2 times.After treatment with optimum conditions，the ratio of deproteinization and polysaccharide loss were 89.73%and 27.46%，respectively.Enzyme-Sevag method is effective and alternative and can be used for removing protein from polysaccharide of Enteromorpha prolifera.

Enteromorpha proliferate；polysaccharides；deproteinization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.022

2013-12-03

山东省高等学校科技计划项目（J11LF71）

唐志红（1974—），女（汉），副教授，博士，研究方向：海洋生物活性物质。