法舒地尔对大鼠脑缺血/再灌注神经元细胞凋亡作用的研究

郭 淼（山东省济宁市第一人民医院，山东 济宁 272111）

法舒地尔对大鼠脑缺血/再灌注神经元细胞凋亡作用的研究

郭 淼
（山东省济宁市第一人民医院，山东 济宁 272111）

目的 探讨法舒地尔干预后对大鼠脑缺血/再灌注神经元细胞是否具有抗凋亡作用。方法 解剖SD大鼠分离脑缺血/再灌注神经元细胞细胞，不同浓度法舒地尔干预后，运用TUNEL法检测大鼠脑缺血/再灌注神经元细胞的凋亡情况。结果 法舒地尔能明显减少TUNEL染色阳性细胞数，且浓度越高作用越明显。结论 法舒地尔干预后对大鼠脑缺血/再灌注神经元细胞具有抗凋亡作用。

法舒地尔；细胞凋亡；神经元细胞

法舒地尔（即盐酸法舒地尔，F a su d i l hydrochloride，FH）是目前在临床上唯一应用的Rho激酶抑制剂［1］，最初只是作为一种血管扩张剂，在神经内科用于防治蛛网膜下腔出血后的慢性脑血管痉挛，近年来其临床应用扩展到心血管领域［2］。Rho激酶作为细胞内信号转导和分子开关，参与许多机体重要的调节作用，如诱导细胞凋亡［3-5］，调控基因转录、细胞黏附与迁移等。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠，体重80～100 g；法舒地尔注射液购自中国山西普德公司；二甲基亚砜（DMSO）购自美国Saldrich公司，DMEM培养基及胎牛血清购自澳洲Hyclone公司。

1.2 大鼠脑缺血/再灌注神经元细胞分离与细胞传代培养

选取体重80～100 g的健康雄性SD大鼠，麻醉、消毒后解剖取出脑组织，将脑组织移至超净台，放入磷酸缓冲盐溶液（PBS）中洗净血液。将其剖开、剪成0.5～1 mm的小块，然后立即移至含10%胎牛血清（FBS）的培养基（DMEM）中，37℃、5% CO2温箱中培养。当细胞铺满瓶底90%左右时，0.25%胰酶消化，然后按1：3比例接种到细胞培养瓶进行传代培养，取3～6代细胞进行实验。

1.3 法舒地尔药物干预分组

待细胞生长至70%～80%汇合度后换用无血清培养液培养24 h，使细胞处于饥饿状态，然后换成含10%FBS的DMEM培养液培养，分别加入不同浓度（1 μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L）的法舒地尔孵育48 h，收集细胞用于后续实验。实验共分为四组：A为对照组；B组为法舒地尔1 μmol/L干预组；C组为法舒地尔10 μmol/L干预组；D组为法舒地尔100 μmol/L干预组。

1.4 TUNEL法检测细胞凋亡情况

移除细胞培养液，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定细胞30 m in，加入0.1% Triton X-100透化细胞2 m in；实验组各加TUNEL反应混合液100 uL于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃，1 h。终止反应：浸入2×SSC 15 m in；封闭POD：浸入0.3%H2O215 m in；酶标反应：加streptavidin100 uL标记HRP（按1：500 PBS稀释）30 m in；DAB显色（避光）：加DAB混合液100 uL，10 m in左右加PBS或甘油1滴在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计500个细胞）并拍照。计数TUNEL阳性细胞数（胞核呈棕黄色颗粒）和细胞总数，以TUNEL阳性率表示细胞凋亡。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析，数据均以“±s”表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

TUNEL染色结果显示，对照组有大量的细胞凋亡，与对照组相比法舒地尔干预组细胞凋亡比例明显降低，而且剂量越大降低越明显，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 细胞凋亡直方图

3 讨 论

法舒地尔干预后对大鼠脑缺血/再灌注神经元细胞具有抗凋亡作用，在下一步的工作当中我们会对它的机制进行研究［6-7］。

［1］ Sm lyo AP Som ly AV.Signal transduction by G-proteins Rho kinase and protein phosphatase to smooth muscle and non-muscle myosin II［J］.J Physiol，2010，522（Pt2）：177-185.

［2］ Fukumoto Y，Mohri M，Inokuchi K，et al.Anti-ischem ic effects of fasudil，a specific Rho-kinase inhibitor，in patients w ith stab le effort angina ［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，49（3）：117-121.

［3］ Otsuka t，Ibuki C，Suzuki T，et al.Adm inistration of the Rhokinase inhibitor，fasudil follow ing nitroglycerin additionally dilates the site of coronary spasm in patients w ith vasospastic angina［J］.Coron Artery Dis，2008，19（2）：105-110.

［4］ Satoh S，Utsunom iya T，Tsurui K，et al.Pharmacological profile of hydroxy fasudil as a selective rhokinase inhibit or onischemic brain damage［J］.Life Sci，2001，69（12）：1441.［5］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible m iddle cerebral artery occlusion w ithout craniectomy in rats［J］. Stroke，2009，20（1）：84-91.

［6］ 邵建林，王玲玲，王俊科，等.七氟烷激活PI3-K/A k t/ P70S6K信号转导通路抑制缺血/再灌注损伤神经元的凋亡［J］.中国药理学通报，2006，22（11）：1362-7.

［7］ Rikitake Y，K im H H，Huang Z，et al.Inhibition o f Rhokinase（ROCK）leads to increased cerebral blood flow and stroke protection［J］.Stroke，2005，36（10）：2251-7.

本文编辑：吴玲丽

Effect of Fasudil Attenuates Neuron Cell of Rat Apoptosis

GUO M iao
（Shandong Province Jining City the first people's hospital，Shandong Jining 272111，China）

Ob jective To investigate the effect of Fasudil attenuates Neuron Cell of Rat apoptosis. M ethods Anatomy of SD rats were isolated from cerebral ischem ia/reperfusion neuron cells，different concentrations of fasudil intervention，using the TUNEL assay in rats w ith cerebral ischem ia/reperfusion neuronal cell apoptosis. Results TUNEL results showed attenuation of apoptosis on Neuron Cell of Rat。Conclusion Fasudil has the function of attenuate cell apoptosis.

Fasudil；Cell apoptosis；Neuron Cell；

R743

A

ISSN.2095-6681.2015.026.007.02