结核T细胞斑点试验在结核性胸膜炎中的价值

庄 妍，赖雁平

（天津医科大学第二医院呼吸内科，天津 300211）

结核病大多表现为肺结核，但仍有15%～25%的患者为淋巴结结核或结核性胸膜炎[1]。该病临床症状多不典型，确诊需在胸腔积液或胸膜组织中找到结核菌，但结核菌培养的阳性率低，培养周期长。应用胸膜活检也可以确诊，但具有创伤性，使其应用受限。目前外周血结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB）对于结核病的辅助诊断价值得到国内外的一致认同，但胸腔积液T-SPOT.TB对结核性胸膜炎的诊断价值仍存在争议。90%结核性胸膜炎表现为以淋巴细胞为主的渗出性胸腔积液，因此在临床工作中，此检验结果多提示高度可疑结核性胸膜炎。本研究旨在探讨T-SPOT.TB对鉴别诊断结核性胸膜炎和其他淋巴细胞为主的渗出性胸腔积液的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年1月-2014年4月我院呼吸科收治的单侧胸腔积液患者63例，其均符合淋巴细胞为主的渗出性胸腔积液。渗出液的诊断标准参考Light’s标准[2]，即以下3项标准中符合任何一项即可确诊为渗出液，均不符合则为漏出液：（1）胸液/血清蛋白（P/SPro）＞0.5；（2）胸液/血清乳酸脱氢酶（P/SLDH）＞0.6；（3）胸液乳酸脱氢酶（PE LDH）大于正常血清乳酸脱氢酶上限的2/3。淋巴细胞为主的诊断标准为胸腔积液细胞分类计数中淋巴细胞占有核细胞的比例>50%。全部病例中结核性胸膜炎患者32例，其中经病原学确诊（胸腔积液或胸膜活检组织培养出结核分枝杆菌）13例，经组织学确诊（胸膜活检病理示干酪样肉芽肿）6例，临床诊断[3]13例，且经抗结核治疗有效。非结核性胸膜炎患者31例，均已排除结核性胸膜炎，且明确诊断其他疾病，经治疗原发病有效。其中恶性胸腔积液19例（肺癌16例、乳腺癌1例、卵巢癌1例、淋巴瘤1例），肺炎旁胸腔积液9例，系统性红斑狼疮1例，类风湿性关节炎1例，肝硬化1例。入选者均签署知情同意书，且排除：<16岁，孕妇，HIV阳性，近1周内应用利尿剂，因肝病或严重营养不良所致低蛋白血症。

1.2 方法 采集所有患者（治疗前）外周静脉血5 mL和新鲜胸腔积液50mL，应用肝素抗凝管，室温保存，标本采集后2 h内送检，4 h内完成检测。应用T-SPOT.TB试剂盒（英国，Oxford Immunotec公司），标本经分离得到外周血单核细胞（PBMCs）和胸液单核细胞（PEMCs），制备成细胞悬液。在包被γ-干扰素抗体的微孔板上，加入细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素作为阳性对照，结核分枝杆菌特异性抗原—早期分泌靶向抗原6 kD和培养滤过蛋白10 kD作为刺激抗原。每孔加入细胞悬液，放在培养箱中培养18～20 h，洗板后加入生物素标记的二抗，4℃反应1 h，洗板后加入显色底物液，静置7min，去离子水终止反应。通过T淋巴细胞酶联免疫斑点系统记录斑点形成细胞数。结果判定：若阴性对照孔的斑点数<10，且阳性对照孔的斑点数>20，试验有效。若空白对照孔斑点数<6，且任一试验孔斑点数－空白对照孔斑点数≥6，结果为阳性；当空白对照孔斑点数>6，且任一试验孔斑点数≥2×空白对照孔斑点数时，结果亦为阳性。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件处理数据。敏感性=阳性例数/总例数，特异性=1－敏感性。所有数据均首先进行正态分布检验，符合正态分布的计量资料用x±s表示，采用t检验进行组间比较；非正态分布的计量资料用中位数 [四分位间距]表示，采用非参数秩和检验进行组间比较。两组间一般情况中的分类变量及反应率比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征（ROC）曲线对诊断价值进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者基本情况及检验指标 表1列出了受试者的年龄、性别、近1月有无应用激素或免疫抑制剂、有无结核病史或影像学陈旧性肺结核改变、有无糖尿病、高血压等基础疾病及外周血和胸腔积液中的一些检验指标，其中结核性胸膜炎组胸液中的中性粒细胞比例较非结核性胸膜炎组高（P<0.05）。

表1 受试者基本情况及检验指标Tab1 Generalcausesand physicalexam inationsof sub jects

2.2 T-SPOT.TB测定 32例结核性胸膜炎患者外周血T-SPOT.TB检测结果为29例阳性，3例阴性，胸腔积液检测结果为30例阳性，2例阴性。31例非结核性胸膜炎患者外周血T-SPOT.TB检测结果为10例阳性，21例阴性，胸腔积液检测结果为3例阳性，28例阴性。胸腔积液检测的敏感性高于外周血，但无统计学意义（P>0.05）；其特异性明显高于外周血（P<0.05）。胸腔积液释放γ-干扰素的特异性T细胞数显著高于外周血（P<0.05）。见表2。

表2 外周血与胸腔积液的T-SPOT.TB检测结果Tab2 The data of serum and pleural T-SPOT.TB

2.3 绘制ROC曲线 在63例胸腔积液患者中，以病原学/组织学或临床诊断作为确定结核性胸膜炎的标准，以释放γ-干扰素的特异性T细胞数为标准绘制ROC曲线，见图1。外周血的ROC曲线下面积为0.880，当取值分别为21和75 SFCs/106PBMC时，敏感性分别为81.3%和65.6%，特异性为77.4%和96.8%。胸腔积液的ROC曲线下面积为0.964，当取值分别为12和133SFCs/106PEMC时，敏感性分别为93.8%和81.3%，特异性为90.3%和96.8%。

图1 外周血及胸腔积液T-SPOT.TB的ROC曲线Fig 1 ROC curveof serum and pleural T-SPOT.TB

3 讨论

结核杆菌感染产生以细胞介导为主的免疫反应，T淋巴细胞在初次感染致敏后成为记忆T细胞在体内长期存在，当再次接触结核杆菌时活化增殖为效应T细胞，释放多种细胞因子，其中由辅助T淋巴细胞（CD4+、CD8+）产生的 γ-干扰素是最为关键的细胞因子[4-5]。T-SPOT.TB以早期分泌靶向抗原6 kD和培养滤过蛋白10 kD为特异性抗原，刺激从外周血或体液分离的单核细胞产生γ-干扰素，再通过酶联免疫斑点技术计数特异性T细胞数目。这些特异性抗原由RD1基因区所编码，该区域仅存在于结核分枝杆菌和少数致病性分枝杆菌的基因组中，不存在于非致病性分枝杆菌属和卡介苗疫苗株中，且两种抗原联合检测针对不同表位进行反应，从理论上保证了T-SPOT.TB的高敏感性和特异性。但在结核病流行地区，外周血T-SPOT.TB的特异性较低，为67.0%～90.5%[6-7]，这是由于结核疫区存在较多的潜伏感染患者所致。理论上活动性结核感染的T-SPOT.TB的斑点数应较潜伏性感染更多，但事实并非如此，其可能的原因为：当潜伏性结核感染者的免疫功能良好时，少量抗原刺激就能激发出活跃的免疫反应；或者当活动性结核患者免疫功能低下时，大量抗原刺激也不足以激起有效的免疫反应。在此种背景下，选择特异性较高的临界值，比根据ROC曲线确定的最佳临界值更有意义[8]。作为临床医生，需要在不同的临床背景下选择对于实际工作最理想的临界值。正如本研究所示，在外周血及胸液临界值分别取值75 SFCs/106PBMC和133 SFCs/106PEMC时，其特异性较高。在肺外结核病中，结核抗原特异性效应T细胞迅速增殖，并被募集到感染部位，病变局部呈免疫病理学的隔室化反应[9]，故外周血中的效应T细胞减少，感染部位的效应T细胞增多，因此理论上认为对感染部位进行T-SPOT.TB检测有可能获得更高的敏感性和特异性。目前有学者认为T-SPOT.TB的检测范围已不仅局限于外周血，还可应用于痰液、胸水、腹水及脑脊液等[10-11]。但对于胸腔积液T-SPOT.TB的研究结果仍存在争议，有些学者认为其对结核性胸膜炎的诊断价值高于外周血[12-13]，有些则认为其不确定因素较多，结果不尽人意[8]。而我们的研究认为胸液T-SPOT.TB的敏感性、特异性均高于外周血。

结核性胸膜炎是结核分枝杆菌及代谢产物直接侵及胸膜腔引起的胸膜炎症，多表现为淋巴细胞为主的渗出性胸腔积液。在临床工作中，肺炎旁胸腔积液、脓胸的患者通常表现为高热、严重感染症状、血象升高，胸腔积液为脓性或中性粒细胞为主，与结核性胸膜炎鉴别诊断较容易。但仍有17%的结核性胸膜炎的胸腔积液中淋巴细胞比例<50%，本研究只讨论了淋巴细胞为主的渗出性胸腔积液中TSPOT.TB的诊断价值，而以中性粒细胞为主的渗出液未在研究范围之内。此外，本研究通过Light’s标准判定渗出性胸腔积液，但应用利尿剂可以将一部分漏出液错误地判断为渗出液，且低蛋白血症亦可能影响渗出液的判定，因此本研究将近1周内应用利尿剂及各种原因所致的低蛋白血症患者作为排除标准。目前国内对于T-SPOT.TB的研究样本量均偏小，本研究同样存在此问题，尚需在今后的研究中扩大样本量；另外，最终诊断为结核性胸膜炎的个别病例通过临床确诊，可能会影响结果的严谨性，但若将临床确诊病例全部排除，只研究微生物或病理确诊病例，可能仍不可避免地造成结论存在一定偏差。

最终，我们的研究得到以下两个主要结论：一是胸液T-SPOT.TB是较好的诊断结核性胸膜炎的指标;二是当胸液T-SPOT.TB斑点数≥133 SFCs/106PEMC时具有较高的诊断特异性。

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