一种测定亳菊提取液中总黄酮含量的方法

郭敏 陈佩 张秋香 张灏

摘要[目的]研究一株具有降糖作用的鼠李糖乳杆菌发酵生产酸豆乳的工艺条件。 [方法]以产品的酸度、感官评定值为主要指标，采用单因素和正交试验对降糖鼠李糖乳杆菌发酵生产酸豆乳进行条件优化。[结果]试验表明，降糖鼠李糖乳杆菌酸豆乳的最佳工艺条件为：豆水比1∶7 g/ml、蔗糖7% 、接种量5%、37 ℃发酵8 h。[结论]试验得出的工艺条件合理可行，为具有降糖作用的鼠李糖乳杆菌在酸豆乳中的应用提供了一定的技术参考。

关键词 鼠李糖乳杆菌；豆乳；工艺研究

中图分类号S509.9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）34-092-03

酸豆乳是一种以大豆为原料，经乳酸菌发酵而成的豆制品。大豆含有丰富的蛋白质、膳食纤维、脂肪、人体所必需的氨基酸及大豆异黄酮等成分[1]，通过乳酸菌的发酵作用后不仅保留了大豆的营养价值，而且在改变产品的质构后还能提高风味和保藏特性，也可以将大豆异黄酮转化为活性成分，同时产生多种功能性的多肽[2]（7-12）。因而将豆乳作为有益乳酸菌的食物载体可赋予产品特定的健康属性。

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）是人体正常菌群之一，肠道粘着率高，定殖能力强，并具有高效降胆固醇，促进细胞分裂的作用，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要的生理保健功能[3-4]。笔者以江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室分离出的一株具有降糖作用的鼠李糖乳杆菌为发酵剂[5]，发酵生产豆乳，以产品的酸度、感官评定值为主要指标，在单因素和正交试验的基础上，得出最佳工艺参数，以期为具有潜在降糖作用的鼠李糖乳杆菌在酸豆乳中的应用提供一定的技术参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试原料。

脱脂奶粉，光明乳业股份有限公司；全脂奶粉，双城雀巢有限公司；大豆，超市购买。

1.1.2菌株。

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），由江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室分离获得。

1.1.3主要儀器与设备。

DM2000显微镜，德国Leica公司；5415R离心机，德国Eppendorf公司；恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；320S pH计、EL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；MLS3750灭菌锅，日本Sanyo公司；SWCJ1CV超净台，苏州安泰空气技术有限公司；UV2100紫外可见分光光度计，尤尼科上海有限公司；NDJ/79型粘度仪，同济大学机电厂；手动移液枪，美国Rainin公司。

1.2工艺流程

酸豆乳的制作工艺流程如下所示[2]（7-12）：

大豆→去杂→热烫灭酶（4 min）→浸泡（0.5% NaHCO3溶液，12 h）→清洗→去皮（豆水比1∶7）→热水磨浆（80 ℃）→过滤→调浆（7%蔗糖）→均质→杀菌（121 ℃，15 min）→接种→发酵→低温后熟→酸豆乳。

1.3方法

1.3.1发酵用菌种的处理。

将菌株接种于MRS液体培养基中，活化3代后，6 000 r/min离心15 min，菌体用灭菌生理盐水洗涤3次后制成菌悬液于4 ℃保存备用。

1.3.2接种量对酸豆乳的影响。

取20 ml豆乳（豆水比1∶7 g/ml），将菌液按照1%、3%、5%和7%（V/V）的接种量分别接种到豆乳中，37 ℃厌氧培养8 h，发酵结束后测定其酸度和活菌数。

1.3.3发酵温度对酸豆乳的影响。

取20 ml豆乳（豆水比1∶7 g/ml），按照5%（V/V）的接种量接种入豆乳中，分别于33、37、42、45 ℃条件下厌氧培养8 h，发酵结束后测定其酸度和活菌数。

1.3.4发酵时间对酸豆乳的影响。

取20 ml豆乳（豆水比1∶7 g/ml），按照5%（V/V）的接种量接种入豆乳中，于37 ℃条件下厌氧培养6、8、10、12 h，发酵结束后测定其酸度和活菌数。

1.3.5正交试验酸豆乳发酵条件优化。

在单因素试验的基础上，以接种量、发酵温度和发酵时间为因素取不同的水平（表1），以感官评分作为评定指标进行正交试验，确定酸豆乳的最优发酵条件。

1.3.6酸豆乳储藏稳定性分析。

将发酵结束的酸豆乳在4 ℃下静置储藏21 d。每隔7 d取样品测定其pH、酸度、活菌数及脱水收缩率[6]。

1.4指标测定

pH的测定[7]：用pH计测定（发酵样品温度20 ℃）。

滴定酸度的测定[7]：称取10.0 g样品放于100 ml的三角瓶中，加入20 ml去离子水和0.5 ml 0.5%的酚酞指示剂，充分摇匀后，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定样品直至出现微红色，并且红色在1 min内不消失为止。记录消耗的NaOH溶液的体积（ml）并乘以10，即得滴定酸度（°T），重复试验3次取算术平均值。

活菌数测定[8-9]：将0.5 g样品用灭菌的生理盐水梯度稀释至一定倍数后，利用MRS培养基测定发酵乳样品中的活菌数，并计数。

黏度的测定[10]：在25 ℃下，利用黏度计（10×转子）测定发酵乳样品的黏度，重复试验3次取算术平均值。

脱水收缩率的测定[9]：称取15.0 g酸豆乳样品，置于带有滤纸的漏斗中，21 ℃放置90 min，收集滤液并称重。

脱水收缩率（%）=[滤液重（g）/样品重量（g）]×100%

酸豆乳感官评价[11]：感官评定小组由10名经过专业培训的研究生志愿者组成，按照表2各项指标进行评价。

2结果与分析

2.1接种量对酸豆乳的影响

由图1可知，随着接种量的增加，产品的酸度和活菌数呈先上升后下降的趋势，接种量为5%时，酸度和活菌数达到最大值，随着接种量的增加，酸度和活菌数逐渐下降。合适的接种量可以缩短延滞期，使菌种达到最好的生长状态。接种量较少，产酸受到抑制，不能很快形成有利于菌种生长的环境；而接种量过大时，菌丝生长过快，发酵液黏度增加，造成溶氧量不足从而影响发酵产酸[12]（67-74）。从试验结果看，当接种量为3%和5%时，酸度和活菌数都达到最大值，故确定3%和5%为较优接种量。

2.2发酵温度对酸豆乳的影响

发酵温度对菌种的生长及最终发酵产物的生成有很大的影响，合适的发酵温度可以使菌种达到最快的生长速度和获得最高的发酵产率。因为菌种生长和发酵产物的形成都是一系列酶促反应的结果，发酵温度过低，菌种生长慢，产酸低；发酵温度过高时，酶本身很易失活，温度越高，酶失活越快，从而影响发酵产量[12]（67-74）。从图2可以看出，随着发酵温度的上升，产品的酸度和活菌数呈先上升后下降的趋势，当发酵温度在33时，酸度和活菌数都相对较低。故确定42 ℃左右为较适发酵温度。

2.3发酵时间对酸豆乳的影响

由图3可知，随着发酵时间的延长，产品的酸度和活菌数基本呈递增趋势。当发酵时间在8和12 h时，酸度达到较高值，活菌数在12 h时达到最大。因为在前期试验中，该菌在12 h时达到稳定期，故活菌数达到最大值。但是发酵时间过长会有较多乳清析出[13]，故综合考虑确定8 h为较适发酵时间。

2.4正交试验设计及结果

在单因素试验结果基础上，采用L9（ 33 ）正交试验设计，试验结果见表3。

由表3的分析可知，各因素的影响顺序为：A>B>C，即接种量的影响最大，其次为发酵温度，影响最小的是发酵时间。 最佳组合为A2B1C2，即接种量为 5%，发酵温度37 ℃，发酵时间为8 h。

2.5验证试验

按正交试验得出的最优的配比参數组合制作酸豆乳，另选正交试验中感官综合评分最高的3组配方制作酸豆乳与其进行比较，分别测定其酸度、活菌数、黏度及感官值，其结果见表4。

由表4可知，最优水平组合A2B1C2在酸度、活菌数、黏度及感官评定各项指标均最佳，说明最佳参数工艺可靠。

2.6酸豆乳储藏稳定性分析

酸豆乳在4 ℃下储藏28 d，储藏期间酸豆乳的pH、酸度、活菌数的变化和脱水收缩率结果如图4～7所示。从图4～7中可知，随着储藏时间的延长，活菌数和pH逐渐将降低，酸度上升，这是因为在储藏前期，酸豆乳中的活菌的生长代谢使产品pH逐渐降低，酸度升高，而随着储藏时间的延长，体系可利用碳源减少，菌体生长进入衰亡期，从而活菌数逐渐降低[14]。脱水收缩率随着冷藏时间增加总体呈下降趋势，但变化不明显。综合以上指标，在储藏过程中，存在后酸化现象，其余指标变化不大，可通过进一步的技术研究使该菌更适合酸豆乳发酵。

3结论与讨论

该研究得出的一株降糖鼠李糖乳杆菌发酵豆乳的最佳工艺参数为：豆∶水= 1∶7 g/ml，蔗糖的添加量7%，鼠李糖乳杆菌接种量5%，发酵温度37 ℃，发酵时间8 h。

储藏过程中，产品存在后酸化现象，随着冷藏时间延长pH降低，酸度提高，活菌数逐渐降低，脱水收缩性逐渐降低。可通过进一步的技术研究使该菌更适合酸豆乳发酵。

3结论与讨论

该研究得出的一株降糖鼠李糖乳杆菌发酵豆乳的最佳工艺参数为：豆∶水= 1∶7 g/ml，蔗糖的添加量7%，鼠李糖乳杆菌接种量5%，发酵温度37 ℃，发酵时间8 h。

储藏过程中，产品存在后酸化现象，随着冷藏时间延长pH降低，酸度提高，活菌数逐渐降低，脱水收缩性逐渐降低。可通过进一步的技术研究使该菌更适合酸豆乳发酵。