山楂黄酮超高压提取工艺研究

孙协军，李秀霞，冯彦博，张丽华（渤海大学化学化工与食品安全学院辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州121013）

山楂黄酮超高压提取工艺研究

孙协军，李秀霞*，冯彦博，张丽华
（渤海大学化学化工与食品安全学院辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州121013）

对山楂黄酮超高压提取工艺进行了优化研究，以山楂中芦丁、金丝桃苷和槲皮素总得率为响应值，考查了乙醇体积分数、液固比、压力和保压时间对山楂黄酮得率的影响。结果表明，几个考查因素对山楂黄酮得率影响的顺序为：乙醇体积分数＞保压时间＞液固比＞压力；建立了超高压提取山楂黄酮的数学模型，确定超高压提取山楂黄酮的最佳工艺参数为：乙醇体积分数90%，液固比24∶1mL/g，压力500Mpa，保压时间为12min，在此优化条件下超高压提取山楂中黄酮得率为0.0553%；相比于索氏抽提和超声波提取法，超高压提取在提取时间和黄酮得率上都有着明显的优势，对提取残渣的扫描电镜检测结果显示，经过超声波和超高压短时间处理的物料组织结构破坏程度较长时间索氏抽提更大，胞内物质更易于溶出，因此短时间内达到了较高的提取效率。

山楂，芦丁，金丝桃苷，槲皮素，超高压提取

山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）通常是指蔷薇科（Rosaceace）山楂属（Crataegus L.）植物的干燥果实，分为山里红（Crataegus pinnatifida Bge var.Major N.E.Br.）和野山楂（Crataegus cuneata Sieb.&Zucc.）［1］，其中，山里红也叫北山楂，在我国北方地区广泛栽培，是重要的药食同源植物。黄酮类化合物是山楂果实及叶片中主要的生物活性成分，主要包括以芹菜素和木犀草素为苷元的苷类以及以芦丁和金丝桃苷为主的黄酮醇及氧苷类物质［2-4］。黄酮传统的提取方法主要为索氏抽提、回流提取和溶剂浸提等［5-6］，消耗的溶剂多，提取时间长，这些提取方法的优化都在于选择适当的溶剂和温度以提高物料的溶解度和传质速率［7］。萃取效率的提高程度有限，为大幅提高溶剂萃取的效率，需要外加新技术的辅助，超高压提取（UHPE）的压力范围为100～1000MPa，高压可提高溶剂向物料细胞内的扩散效率和待提取物的传质效率，可在室温下进行操作并能缩短提取时间，提高提取效率［8］。此外，UHPE只消耗电能且没有任何废气和排放物，被认为是一种环境友好的提取方法。与煎煮法、热回流法和超声波提取方法相比，超高压提取避免了热敏性成分因受热而失活，从时间、提取率及提取物抗氧化活性方面，超高压提取均表现出很大的优势［9］。

超高压萃取技术在脐橙皮果胶［10］、荔枝黄酮［11-12］、茶多酚［13］、茶叶咖啡因［14］、和香菇多糖［15］等活性成分的提取中得到很好的应用。Guo等报道在压力为500MPa、温度为55℃和保压时间10min条件下，脐橙皮果胶的提取率达到最高，果胶提取率为20.44%，显著高于传统加热提取（15.47%）和微波提取（18.13%）［10］；Zhao等研究结果也表明，在用超高压技术提取时，荔枝黄酮的提取率显著提高，提取物的抗氧化活性比传统提取方法也有了很大的提高［11］；Joo等研究表明，与超声波提取和浸提法相比，C.sinensis茶树多酚提取率和提取物抗氧化能力明显升高［13］；Jun等采用不同方法提取绿茶中咖啡因，研究结果表明，与常温浸提、加热回流提取和超声波提取相比，超高压提取具有提取效率高、时间短和能耗低的优点［14］。超高压技术在山楂黄酮提取工艺应用的研究报道很少，尤其缺乏HPLC精确定量方法的山楂黄酮超高压辅助提取工艺研究的报道，芦丁、金丝桃苷和槲皮素是山楂果实中主要的黄酮类物质［16-17］，因此，本实验以自制山楂粉为原料，采用超高压辅助提取技术，对山楂3种主要黄酮类化合物的超高压辅助提取工艺进行研究，以期为超高压技术在山楂果实有效成分提取方面的应用提供技术依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

山楂市售，产自辽西地区；芦丁和槲皮素标准品（纯度＞97%） 购于中国药品生物制品检定所；金丝桃苷标准品（纯度＞98.5%） 购于宝鸡市辰光生物科技有限公司；高效液相色谱检测所用试剂均为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

P680型高效液相色谱仪（配DAD检测器） 美国戴安公司；FA2004型电子天平上海恒平科学仪器有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；HPB.A2-600/0.4型超高压实验机天津市森淼生物技术有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞破碎仪宁波新芝超声设备有限公司；S-4800型场发射扫描电镜日本日立公司；PS02-AD-DI型超纯水机上海讯辉环保科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵上海申光仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1山楂样品预处理方法选择整齐度良好的新鲜山楂自来水清洗后去除果核，带皮果肉部分在50℃热风烘干后粉碎成细粉，全部过40目分样筛后真空封装，冷藏备用。

1.2.2山楂黄酮提取方法

1.2.2.1超高压提取方法准确称取5g山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，按照实验设计加入相应体积的提取溶剂混合后，封好袋口后放入超高压腔体内进行提取。超高压设备腔体采用去离子水作为流体媒介，升压速度为100MPa/min，降压为瞬间降压（约2～3s）。超高压处理后的混合液减压抽滤，等体积的提取溶剂洗涤抽滤瓶中滤渣，所得滤液在60℃旋转蒸发掉大部分溶剂后，无水乙醇溶解并定容至50mL，0.45μm膜过滤后，HPLC检测3种黄酮浓度，计算黄酮得率。

1.2.2.2超声波提取方法［18］准确称取5g山楂粉于100mL小烧杯中，加入体积分数90%乙醇溶液130mL，在600W超声波功率下提取25min后减压抽滤，收集滤液于60℃减压浓缩至膏状后，甲醇溶解并定容至50mL，HPLC测定总黄酮含量，并计算黄酮得率。

1.2.2.3索氏抽提方法准确称取山楂粉5g，用滤纸包好，放入索氏提取器的抽提室中，100mL 95%乙醇回流提取一定时间，直至回流液无色为止。收集提取液于磨口烧瓶中，60℃减压浓缩，残留物用甲醇定容于25mL容量瓶中，HPLC测定总黄酮含量，并计算黄酮得率。

1.2.3仪器分析条件

1.2.3.1液相色谱检测条件Develosil C30（250mm× 4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：A相为乙腈，B相为0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱，80%B～60.5%B（0～26min），80%B平衡4min后进下一个样品；流速1mL/min；柱温40℃；进样20μL；检测波长：360nm。

1.2.3.2扫描电镜（SEM）条件在SEM样品台上贴上一层双面胶，将提取后的山楂粉末撒于此双面胶上，轻轻吹去多余的粉末，采用S-4800型电子显微镜观察其表面结构，加速电压为1.0～5.0kV。

1.2.4标准曲线的绘制各取芦丁、金丝桃苷和槲皮素标准品48、15、4.5mg，甲醇溶解并分别定容至10mL，得到浓度分别为4.8（芦丁）、1.5（金丝桃苷）和0.45mg/mL（槲皮素）的3种标准品贮备液，分别吸取同体积各标准贮备液，稀释为6个浓度梯度的标准使用溶液，浓度分别为：芦丁，0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16mg/mL；金丝桃苷，0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.001563mg/mL；槲皮素，0.015、0.0075、0.00375、0.001875、0.000938、0.000469mg/mL。

1.2.5山楂黄酮得率的计算方法山楂黄酮得率（%）=［（HPLC测定3种黄酮浓度和×定容体积）/（称样质量）］×100；其中，黄酮浓度单位为mg/mL，体积单位为mL，质量单位为mg。

1.2.6提取单因素实验改变提取剂浓度、压力、乙醇溶剂与山楂粉的液固比、保压时间四项参数的条件，研究上述因素对山楂黄酮得率的影响，为响应面实验确定影响因素和适合水平。

1.2.6.1乙醇体积分数对山楂黄酮得率的影响准确称取5g山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，分别加入体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液，液固比20∶1mL/g，压力为400MPa，保压时间为6min，测定黄酮得率。

1.2.6.2压力对山楂黄酮得率的影响称取5g山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，保压时间为6min，液固比20∶1mL/g，选择1.2.6.1中优化得到的乙醇体积分数，分别在200、250、300、350、400、450、500MPa压力下提取，测定黄酮得率。

1.2.6.3液固比对山楂黄酮得率的影响称取5g的山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，选择上2步实验中优化得到的压力和乙醇体积分数，保压时间为6min，在山楂粉和乙醇溶剂的固液比分别为10、15、20、25、30、35、40、45mL/g条件下提取，测定黄酮得率。

1.2.6.4保压时间对山楂黄酮得率的影响称取5g的山楂粉于聚乙稀袋密封袋中，在已优化的乙醇体积分数、压力和液固比条件下，分别采用保压时间为2、4、6、8、10、12、15、20min提取，测定黄酮得率。

1.2.7响应面实验为进一步确定最佳超高压萃取条件和各因素的影响顺序，依据Design-Expert 7.0进行响应面实验设计，以3种黄酮总得率为考察指标，以乙醇体积分数（X1）、液固比（X2）、压力（X3）和保压时间（X4）为考查因素，共设立30个处理组，具体实验设计见表1。

表1　山楂黄酮超声波辅助提取响应面实验设计Table 1　Response surface experiment design of ultrasound assisted extraction of hawthorn flavonoid

1.2.8数据处理实验数据采用excel 2003和designexpert 8.0.6数学软件进行分析。

2　结果与分析

2.1HPLC分离结果和标准曲线的建立

所配制的标准溶液经0.45μm膜过滤后分别进样，黄酮混合标准溶液及山楂提取液的液相色谱图见图1（A）和图1（B）所示，采用保留时间和光谱扫描图对图1（B）中各种黄酮进行定性［16-17］。以峰面积为横坐标，3种黄酮浓度平均值（mg/mL）为纵坐标，3条标准曲线的回归方程分别为：芦丁，Y=538.31X-0.3226（R2=0.9999；线性范围为0.0005～0.16mg/mL）；金丝桃苷，Y=828.86X（R2=0.9996；线性范围为0.0016～0.05mg/mL）；槲皮素，Y=550.85X+0.044（R2=0.9997；线性范围为0.0005～0.015mg/mL）。

图1　黄酮混合标准溶液（A）和山楂黄酮提取液（B）色谱图Fig.1　Chromatogram of flavonoid mixture standard（A）and hawthorn flavonoid extract（B）

2.2乙醇体积分数对山楂黄酮得率的影响

乙醇体积分数对山楂黄酮得率的影响如图2所示，乙醇体积分数对得率影响较大，体积分数为90%的乙醇得率最高，其次是80%，乙醇体积分数较高或较低得率都不佳。黄酮类化合物易溶于含有一定比例水的乙醇溶液中，乙醇价廉无毒，常用一定体积分数的乙醇溶液作为黄酮类化合物的萃取溶剂［9，19-20］，极性较强的黄酮类化合物随提取剂中乙醇体积分数的增大反而降低［21］，乙醇体积分数增大，黄酮苷元类化合物的溶解性增大，脂溶性黄酮类化合物的溶解性也随之增大，乙醇体积分数为0%～50%内，总黄酮的提取率随乙醇体积分数的增大而增加［19-20］。因此，本实验设定的乙醇体积分数从50%起，随乙醇体积分数的增加（50%～90%），黄酮得率逐渐增加，在超过90%后，山楂黄酮得率逐渐降低，这与以山楂叶为原料的实验结果不同［21］，是因为实验所用原料不同，本实验采用的山楂粉中主要黄酮类物质芦丁和金丝桃苷为黄酮醇类化合物［16-17］，从图2的实验结果中可以看出，90%体积分数乙醇对山楂黄酮类化合物的溶解能力最强，体积分数为80%和90%乙醇为溶剂的得率间没有显著差异（p＞0.05），考虑到成本因素，因此选择体积分数为80%的乙醇进行下一步实验。

图2　乙醇体积分数对山楂黄酮得率的影响Fig.2　Effect of ethyl alcohol volume fraction on the extraction content of flavonoids from hawthorn

2.3压力对山楂黄酮得率的影响

超高压实验机压力对山楂黄酮得率的影响如图3所示，在压力为200～450MPa范围内，随着超高压压力的加大，山楂黄酮得率从0.0285%增加到0.0438%，可见，在一定范围内（200～450MPa），超高压压力的增加有利于山楂黄酮提取效率的提高，这与樊振江等以柿叶为原料和王居伟的提取效果相似［20，23］，提高压力有助于溶剂扩散到物料的细胞内部，加快物料被提取溶剂浸润的速度，并通过升压、保压和卸压等方式，破坏细胞壁和胞内各种膜，打破物料细胞内外平衡，降低了有效成分的传质阻力，加快黄酮物质向外扩散的速率［24］。而在压力超过450MPa后，黄酮得率呈现下降的趋势，可能是较大的压力导致山楂细胞破碎的小颗粒过多，堵塞了活性成分的溶出通道，同时破碎的组织细胞吸附了部分黄酮，导致提取效率反而降低，因此，选择450MPa作为合适的压力进行下一步实验。

图3　超高压压力对山楂黄酮得率的影响Fig.3　Effect of extracting ultrahigh pressure on the extraction content of flavonoids from hawthorn

2.4液固比对山楂黄酮得率的影响

液固比对山楂黄酮得率的影响如图4所示，随着液固比的增大，山楂黄酮得率在一定范围内（液固比10∶1～35∶1mL/g）有增加的趋势，但是液固比在15∶1～35∶1mL/g范围内变化时，黄酮得率的变化很小，这与纵伟等超高压提取金银花黄酮的实验结果相似［25］，说明液固比在15∶1～35∶1mL/g范围内是超高压提取黄酮的适宜范围。当液固比为35∶1mL/g时，得率最高（0.0445%）。这主要是因为随着液固比的增加，活性成分在山楂粉末与提取液接触面间的压力差增大，黄酮类化合物就越容易浸提出来；当液固比增大到一定值后，由于山楂中黄酮类化合物的含量有限，黄酮得率的增加趋于平缓，而后继处理时间的增加导致黄酮损失加大，因此，当液固比超过35∶1mL/g后，随着液固比的继续增大，山楂黄酮得率反而有下降的趋势，考虑到一定的液固比有助于后期抽滤等工作的顺利进行，因此，选择液固比25∶1mL/g进行下一步实验。

图4　液固比对山楂黄酮得率的影响Fig.4　Effect of solvent to solid ratio on yield of flavonoids from hawthorn

2.5保压时间对山楂黄酮得率的影响

保压时间对山楂黄酮得率的影响如图5所示，在保压10min以内，随着保压时间的增加，山楂黄酮得率从0.0428%增加到0.0467%。而当保压时间超过10min后，山楂黄酮得率明显下降，说明长时间处于较高压力下，山楂黄酮的损失增大，而此时，黄酮类物质的浸出已经达到平衡，导致黄酮得率降低。因此，选择保压时间10min进行下一步实验。

图5　保压时间对山楂黄酮得率的影响Fig.5　Effect of retention time of UHPE on extraction content of flavonids from hawthorn

2.6响应面实验结果

通过单因素实验，选取乙醇体积分数（X1）、液固比（X2）、压力（X3）和保压时间（X4）进行四因素三水平的响应面实验，实验设计的因素、水平和实验结果见表2。用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行多元回归拟合，得到山楂中黄酮类化合物得率的回归方程如下：

方差分析结果见表3所示，模型的F值显著（p＜0.05），而失拟的F值不显著（p＞0.05），模型的相关系数R2为76%，说明模型拟合程度较好，可以用该模型方程来分析和预测不同超高压辅助提取条件下山楂黄酮得率的变化。在所选的各因素水平范围内，液固比和保压时间之间存在交互作用显著（p＜0.05），四个考查因素对山楂中黄酮类化合物得率的影响排序为：乙醇体积分数＞保压时间＞液固比＞压力。

2.7最优提取工艺参数的优化

最佳工艺参数为：乙醇体积分数90%，液固比24∶1mL/g，压力500MPa，保压时间为12min，山楂黄酮得率预测值为0.0543%。在优化工艺条件下超高压提取山楂黄酮，其得率为0.0553%，与预测值的相对误差为0.07%。

2.8不同提取方法的比较

分别比较了不同提取方法（索氏抽提、超声波提取和超高压提取）对山楂黄酮提取效率的影响，结果见表4，从表4可以看出，超高压提取技术在提取时间和黄酮得率上均比索氏抽提和超声波提取法有着明显的优势，而索氏抽提一般认为是效率最高的脂溶性活性成分提取方法，因为相比于超声波和超高压这类常温提取方法，索氏抽提通常采用溶剂沸点附近的提取温度，而山楂黄酮的溶解度随温度的增加而不断增大［26］，采用索氏抽提通常可获得较高的提取效率。但在本实验中，超声波提取和超高压提取两种提取方法在山楂黄酮提取效率上显然更有优势，鉴于超声波破碎仪在工作过程中还是会产生一定的热量，有利于提取效率的提高，而超高压则没有热效应，而热醇浸提更有利于黄酮提取效率的提高，为了更好的解释相比于索氏抽提法，超高压冷提技术更有利于山楂黄酮高效提取这一实验结果，利用场发射扫描电镜观察提取前的山楂黄酮干燥粉末以及索式提取、超声波辅助提取和超高压辅助提取后经过50℃烘干的山楂提取后剩余残渣的干燥粉末，结果见图7。从图7可以看出，4种样品通过场发射扫描电镜扫描成像之后，在同样的显微倍数下（4000倍），其微观组织结构出现了很大不同，索氏抽提后的残渣颗粒中，细胞组织表面出现轻微的碎裂痕迹，而超高

表2　响应面实验结果及分析Table 2　Experimental results and analysis of the response surface

表3　方差分析结果Table 3　Analysis of variance results

表4　不同提取方法的比较Table 4　Comparison of different extracting methods

图7　扫描电镜图片（4000×）Fig.7　Scanning electron microscopy photograph（4000×）

压或超声波辅助提取后，残渣颗粒表面孔隙明显变多、变大，其组织结构被破坏的更加严重，表面也变得更为疏松，比表面积增大，这些变化都有利于山楂黄酮类物质的溶出，因此在短时间内，可达到较高的提取效率。

3　结论

对山楂黄酮超高压提取工艺进行了优化，所选择的影响因素的主次顺序为：乙醇体积分数＞保压时间＞液固比＞压力，同时建立了超高压辅助提取山楂黄酮的数学模型，确定超高压辅助山楂黄酮的最佳工艺参数为：乙醇体积分数90%，液固比24∶1mL/g，压力500MPa，保压时间为12min，在此优化条件下超高压提取山楂中黄酮，其得率为0.0553%；比较了索氏抽提、超声波提取和超高压提取对山楂黄酮得率的影响，发现在提取时间和黄酮得率上，超高压提取都有着明显的优势，对各自提取残渣的扫描电镜检测结果表明，经过超声波和超高压短时间处理的物料表面组织结构破坏程度比长时间索氏抽提更严重，因此短时间内可以达到较高的提取效率。

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Optimization of extracting technique assisted by
ultrahigh pressure extraction（UHPE）of flavonoids from hawthorn

SUN Xie-jun，LI Xiu-xia*，FENG Yan-bo，ZHANG Li-hua
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

Extracting technique assisted by ultrahigh pressure extraction method of flavonoids from hawthorn was optimized.The total yields of rutin，hyperin，and quercetin were used as response value，ethyl alcohol volume percentage，liquid to solid（L/S）ratio，power，and retention time were investigated in this experiment. The results showed that the sequence of different factors on flavonoid yield was：ethyl alcohol volume percentage＞retention time＞L/S ratio＞power；and the mathematical model of ultrahigh pressure extraction hawthorn flavonoid extraction was established，the optimal condition was that ethyl alcohol volume percentage 90%，L/S 24∶1mL/g，ultrahigh pressure 500MPa，retention time 12min，under the optimal condition，the hawthorn flavonoid yield was 0.0553%.Compared with sohxlet extraction method and ultrasonication extraction，there was obvious advantage at extracting time and extracting efficiency，it was observed from the scanning electron microscopy（SEM）that the destroy was more serious after treated by ultrasound and ultrahigh pressure than by long time sohexlet extracting，intracellular substances were dissoluted easier，and higher extraction efficiency was achieved within a short time.

hawthorn；rutin；hyperin；quercetin；ultrahigh pressure extraction

TS219

B

1002-0306（2015）02-0291-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.54

2014－07－02

孙协军（1969-），男，本科，实验师，主要从事食品资源开发利用方面的研究。

李秀霞（1973-），女，博士研究生，副教授，主要从事水产品贮藏加工方面的研究。

“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD29B06）；辽宁省食品安全重点实验室开放课题（LNSAKF2011015）。