芽孢杆菌弹性蛋白酶基因的克隆、表达及其大豆肽的制备能力鉴定

宋　笛，刘艳芝（.长春职业技术学院，吉林长春30033；2.吉林省农科院农业生物技术研究所，吉林长春30033）

芽孢杆菌弹性蛋白酶基因的克隆、表达及其大豆肽的制备能力鉴定

宋笛1，刘艳芝2，*
（1.长春职业技术学院，吉林长春130033；2.吉林省农科院农业生物技术研究所，吉林长春130033）

从芽孢杆菌中克隆得到弹性蛋白酶并命名为TX1，并连入pEAZY E1载体，构建了原核表达载体pEAZY E1-TX1。重组质粒导入大肠杆菌BL21后，经IPTG诱导基因表达。表达产物经Ni柱纯化后通过pH-stat测定其制备大豆肽的水解能力。序列分析结果表明TX1基因长度为1143bp，与Genbank上已报道序列（JQ305692.1）同源性最高为99.48%，产生的碱基突变不影响其氨基酸编码。蛋白表达分析结果表明，当IPTG浓度为0.3mmol·L-1，诱导4h蛋白表达量最高。经SDS-PAGE和Western分析结果表明，经Ni离子亲和层析纯化获得量大小为39.4ku的弹性蛋白酶His-TX1。初步确定其在50℃、pH为7.4反应4h时的大豆肽水解率最高，达到14.51%。

芽孢杆菌，弹性蛋白酶，克隆，大豆肽

尽管豆粕中含有丰富的蛋白质，但是作为大豆食用油生产的副产品，目前仍主要作为动物饲料使用。然而，通过蛋白酶消化、微生物发酵结合其他物理化学手段处理，可以将大豆和豆粕中的分子量较大的蛋白质降解为具有良好热稳定性、水溶性、乳化性、抗凝胶性、低粘度等理化性质的低分子活性肽（分子量＜1000u），即大豆肽。研究表明［1-2］大豆肽含有丰富的必须氨基酸、且非常利于人体吸收，除了能够作为食品添加剂改善食物口感，还能通过调节“负氮平衡”有效地缓解机体的缺氧、提高机体免疫力［3-5］，并能够通过抑制血管紧张素转换酶（ACE）的活性，控制高血压的形成［6-8］。

目前生产大豆肽的主要工业手段是微生物发酵法和蛋白酶消化法［9-10］。尽管微生物法廉价且高效，但存在较为严重的安全问题，很多优良的产酶菌株在发酵过程中会产生有毒的或是有害的副产物［11］。通过现代生物技术从微生物基因组中克隆具有良好理化性质的蛋白酶并在大肠杆菌、酵母以及动植物细胞体内实现表达，对推动以大豆和豆粕为原料生产大豆肽具有十分重要的意义。

在以往的研究中，研究者大多选择木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等具有极高蛋白水解能力的蛋白酶，本研究选择在对豆粕水解释放大豆肽的同时尽可能避免产生苦味蛋白，并以能够提高食物口感的弹性蛋白酶［12］作为研究对象，通过PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组中成功克隆了弹性蛋白酶基因TX1，并构建了pEAZY E1-TX1原核表达载体，通过IPTG诱导实现了弹性蛋白酶的原核表达，并初步测定了其对豆粕的降解能力，为进一步利用该弹性蛋白酶进行大豆肽的生产奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌种EL31410购自北京鼎国生物技术有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞Trans1-T1、BL21、原核表达载体pEASY-E1 Expression Kit购自北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒酶天根生化科技（北京）有限公司；EasyPfu DNA Polymerase酶北京全式金生物技术有限公司；质粒小量提取试剂盒宝生物工程（大连）有限公司；ProteinFind Anti-His Mouse Monoclonal Antibody北京全式金生物技术有限公司；超敏快速Western试剂盒海基生物有限公司；豆粕购自辽宁爱普罗斯饲料有限公司；其他化学试剂如无水乙醇、氯仿、苯酚等为国药分析纯。

梯度PCR仪购自东胜隆生物技术有限公司；超净工作台、水平电泳仪、垂直电泳仪购自美国伯乐生物有限公司。

1.2实验方法

1.2.1弹性蛋白酶基因TX1的克隆及表达载体的构建使用细菌基因组提取试剂盒提取芽孢杆菌EL31410的基因组DNA并稀释至50ng/μL作为模板，根据GenBank中芽孢杆菌弹性蛋白酶基因（GenBank：JQ305692.1）序列设计引物TXF（5’-ATGAGAAGCAA AAAATTGTGGATCAGC-3’）和TXR（5’-TTATTGTG CAGCTGCTTGTACGTTGA-3’），利用PCR法扩增目的片段。PCR反应使用EasyPfu DNA Polymerase酶并按照其说明书进行扩增，PCR程序为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃后延伸5min。

按照pEASY-E1 Expression Kit说明书将PCR产物连接到表达载体pEASY-E1上转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，将经鉴定的重组子交由上海杰瑞基因有限公司进行测序，测序结果与GenBank上已发布的序列进行比对。并将序列插入方向正确的克隆命名为pEASY E1-TX1。提取该质粒转化工程菌BL21感受态细胞。

1.2.2TX1基因的表达条件优化将携带原核表达载体pEASY E1-TX1的工程菌BL21细胞在LB培养基上培养至OD值0.6时，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6mmol·L-1的IPTG，28℃诱导4h，并通过12%的SDS电泳分析IPTG浓度对诱导结果的差异。并在加入0.3mmol·L-1的IPTG条件下诱导0、2、4、6h，分析不同诱导时间对诱导结果的差异。

1.2.3目的蛋白的纯化回收将经0.3mmol·L-1IPTG诱导4h的菌液离心收集菌体，并用0.1倍体积的PBS缓冲液重悬菌体，400W超声波破碎5s间隔10s，共计20个循环。15000g离心5min收集上清并利用Ni柱纯化目的蛋白。通过12%的SDS电泳分析纯化效果，并将纯化后的蛋白经10%的SDS电泳后于半干转膜仪中转移到PVDF膜上，并利用商业化的His抗体进行Western杂交分析。

1.2.4弹性蛋白酶活性分析分别称取500mg豆粕粉末加入5mL不同pH（3.6、5.6、7.4、9.0、9.5、10.6）的0.2mmol·L-1的缓冲液（pH3.6乙酸-乙酸钠，pH5.6磷酸钠，pH7.4～9.0的硼酸-硼酸钠，pH9.5～10.6的碳酸钠）中，并向其中依次添加10mg经纯化的弹性蛋白酶，在50℃条件下反应4h，并利用优化的pH-stat法［13］测定弹性蛋白酶对豆粕的水解度。在pH7.4的硼酸-硼酸钠缓冲液中不同温度（4、25、37、42、50、65、70℃）条件下4h消化处理后，测定该弹性蛋白酶对豆粕的水解度。

水解度（%）=（碱的消耗量×碱的摩尔浓度）/（大豆分离蛋白氨基的平均解离度×被水解蛋白的质量×每克蛋白底物具有肽键的物质量）×100

2　实验结果

2.1弹性蛋白酶基因TX1的克隆与原核表达载体构建

如图1所示，通过PCR成功获得与目的基因大小相符的DNA片段。将该片段连接到原核表达载体pEASY E1并进行测序发现，该序列全长1320bp，包含一个1143bp的阅读框，编码由380个氨基酸构成的弹性蛋白酶，和一个177bp的3’非翻译区序列。编码区与已发表的序列（GenBank：JQ305692.1）进行比对结果发现，同源性为99.48%，共计出现6个碱基差异，其中第327位（C→G）、393位（C→A）、420位（T→A）、541位（C→A）、582位（C→A）、1032位（A→T）均不影响氨基酸的编码。选择目的基因片段正确插入到原核表达载体pEASY E1的重组子，即T7启动子→SD序列→TX1基因→T7终止子的重组子命名为pEASYE1-TX1。

图1　弹性蛋白酶基因TX1的克隆与原核表达载体构建Fig.1　The Cloning of Elastase gene named TX1 and the construction of recombinant expression plasmid

2.2TX1基因的表达条件优化

通过对不同诱导条件的比较发现，当加入IPTG浓度为0.3mmol·L-1时，39.4ku处的目的蛋白表达量不再增加（图2B）；而当诱导时间达到4h以后目的基因的蛋白表达量也没有明显变化（图2A）。可以推断最佳诱导条件为28℃条件下，0.3mmol·L-1IPTG诱导4h。

图2SDS-PAGE检测His-TX1的表达Fig.2　The expression of His-TX1 detected with SDS-PAGE

2.3目的蛋白的纯化回收

如图3所示，SDS-PAG结果表明，经Ni柱纯化的洗脱液中仅含有一条分子量大小为39.4ku的蛋白条带。Western杂交结果进一步证明了洗脱液中的蛋白条带为经IPTG诱导表达的弹性蛋白酶His-TX1。

图3　融合蛋白His-TX1的纯化与鉴定Fig.3　Purification and analysis of His-TX1 fusion proteins

2.4弹性蛋白酶活性分析

经测定纯化后的弹性蛋白酶His-TX1在pH3.6～10.6之间均能够水解豆粕，且pH5.6～9.0之间其水解度高于10%，而在温度37～65℃范围同样能够达到10%以上，因此该蛋白酶能够在较宽泛的温度和pH范围内使用。通过对不同条件下豆粕为底物的水解度曲线分析确定，当50℃，pH7.4时，该弹性蛋白酶活力最高，其对豆粕的水解度为14.51%。

图4　不同处理对水解度的影响Fig.4　The effect of different treatments on protein hydrolysis

3　结论与讨论

本研究成功的通过PCR法克隆了枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶TX1基因，通过IPTG诱导表达并纯化了重组弹性蛋白酶His-TX1，经实验证实其在最适条件（50℃，pH7.4）下其对豆粕的水解度为14.51%，适合进行工业化生产大豆肽的要求。并且发现其在pH5.6～9.0，温度范围37～65℃，对100mg/mL的豆粕为原料进行大豆肽水解均可获得10%以上的水解度，适合作为工程酶进行大豆肽的工业化生产。

郭玉华等［12］研究表明，与传统使用的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等不同，弹性蛋白酶不易造成过分水解所导致的食物口感下降和苦味物质的产生。因此，编码弹性蛋白酶的TX1基因的克隆与表达及其进行对豆粕水解条件的测定，为无需脱苦处理的大豆肽生产提供了帮助，为以单纯获得更高的底物（大豆、豆粕）水解度为目标的研究转变为兼顾水解产物口味的研究提供了基础，为推动豆粕水解的大豆肽单纯的作为动物食料转向发展新的食品原料提供了新的思路。

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Cloning and expression of the elastase gene Bacillus subtilis and identification of the ability of preparation of soybean peptide

SONG Di1，LIU Yan-zhi2，*
（1.Changchun Vocational Institute of Technology，Changchun 130033，China；2.Agro-Biotechnology Research Institute，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

A elastase gene named TX1 was isolated from the genomic DNA of Bacillus subtilis by PCR amplification，and constructed into pEAZY E1 vector to generate a recombinant expression plasmid pEAZY E1-TX1.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21.The expression was induced by IPTG and the fusion protein His-TX1 was purified by Ni-NTA.The ability of the purified expression of hydrolysis of Soybean Peptide was identified by pH-stat method.The sequence analysis suggested that TX1 gene was cloned with a length of 1143bp，had 99.48%homology with the Elastase gene（JQ305692.1）published in the GenBank，and the mutants would not infected the sequence of the amimo acids encoded.The analysis of expression showed that the highest expression level was obtained with 0.3mmol·L-1IPTG at 28℃ for 4h.The SDS-PAGE and Western blotting analysis showed that fusion protein which was 39.4ku purified with nickel-nitrilotriacetic acid（Ni-NTA）metal-affinity chromatography matrices was the Elastase His-TX1.The highest hydrolysis activity of HIS-TX1 was detected at 50℃，pH7.4 for 4h，the hydrolysis reached 14.51%.

Bacillus subtilis；elastase；cloning；soybean peptide

TS201.2

A

1002-0306（2015）02-0235-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.042

2014－04－10

宋笛（1982-），硕士研究生，讲师，主要从事生物技术与生物工程领域方面的研究。

刘艳芝（1964-），硕士研究生，副研究员，主要从事转基因农作物方面的研究。

吉林省科技发展计划项目（20125097）。