LEA-motif对胰岛素在低温干燥过程中活性保护的研究

张　燕，李代禧，*，郭柏松，翟　振，刘　立，杨春生，余华星（.上海理工大学食品科学与工程研究所，上海00093；.上海东富龙科技股份有限公司，冻干工艺研究室，上海008）

LEA-motif对胰岛素在低温干燥过程中活性保护的研究

张燕1，李代禧1，*，郭柏松2，翟振1，刘立1，杨春生2，余华星1
（1.上海理工大学食品科学与工程研究所，上海200093；2.上海东富龙科技股份有限公司，冻干工艺研究室，上海201108）

选用LEA蛋白特征重复片段（LEA-motif）作为干燥活性保护剂，以胰岛素为研究对象，研究该天热保护剂对热敏性胰岛素的干燥保护效果和作用机理。模拟采用Gromacs软件及Gromos96（53a6）简化原子力场，并采用REMD广泛采样分子模拟方法。研究结果表明，LEA蛋白特征重复片段对胰岛素的三维活性结构、二级结构都有良好的保护作用。另外，从实验验证结果可知，有LEA-motif保护的胰岛素六聚体活性明显提高。综上可知，LEA蛋白特征重复片段对热敏性蛋白药物有良好的干燥活性保护作用。

胰岛素，LEA-motif，分子模拟，干燥活性保护，结构稳定性，效价

胰岛素（insulin）是机体内能唯一降低血糖的激素，由51个氨基酸组成。有A、B两条肽链，通过两个二硫键连接起来［1］。胰岛素是糖尿病患者治疗的首选药物。然而，胰岛蛋白药物在常温下就很容易变性失活，简单的低温冷冻干燥只能减缓其变性过程，并不能阻止热敏性药物的变性［2］，要想更好地保护热敏性药物的生物活性结构，必须寻求一种安全有效的干燥保护剂来限制胰岛素的有害热运动，防止其发生变性和失活。

胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）是伴随着脱水干燥过程产生的一类低分子量、高亲水性的无定型蛋白［3］，由于LEA蛋白的存在，这类生物能迅速适应高、低温导致的极度缺水环境［4］。脱水过程中，LEA蛋白的无序部分能形成适应其他蛋白的形状，吸附在其他蛋白表面，形成保护层，从而防止了蛋白的脱水变性、聚集变性和受热变性。LEA蛋白一般分为6类，其中第3组蛋白分布更广，同源序列为11个氨基酸的串联重复排列，可形成亲水性的α-螺旋结构。所以对于第3组LEA蛋白及其特征重复片段研究具有重要意义。另外，实验室课题组以LEA蛋白［5］以及构成LEA蛋白的氨基酸［6］为保护剂分别对胰岛素的保护效果做过一定研究，研究结果表明这两种物质作为保护剂对胰岛素在干燥过程中的活性保护效果显著。然而，Shimizu T［7］报道，LEA蛋白的11个氨基酸特征重复片段才是LEA蛋白对植物在胁迫环境下保护作用的体现者。因此，本课题决定采用第3组LEA蛋白（AaVLEA1）［8］的特征重复片段（LEA-motif，LEAM）作为保护剂来研究其对热敏性药物胰岛素在干燥过程中的活性保护效果。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

猪胰岛素（1306A04） 江苏徐州万邦生化医药股份有限公司；LEA蛋白特征重复片段（LT130325-LT342888，纯度95.47%） 北京泽溪源生物科技有限公司；无水硫酸钠（分析纯）和乙醇胺上海润捷化学试剂有限公司；磷酸（分析纯） 江苏强盛功能化学股份有限公司。

高效液相色谱仪、Waters e2695分离模块和Waters 2998光电二极管检测器均购自沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；LYO-0.2型冻干机上海东富龙科技股份有限公司；XS205型称重天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司。

1.2模拟方法

胰岛素采用蛋白质数据库中的晶体结构（3inc）作为初始结构（图1A）。选用第三组LEA蛋白（AaVLEA1）的特征重复片段11个氨基酸序（KTAEFRDSAGE）作为胰岛素的干燥活性保护剂（图1B）。

图1　胰岛素（A）和LEAM（B）结构Fig.1　The structures of insulin（A）and LEAM（B）

在4种不同水分含量下，研究不同数目保护剂对胰岛素的干燥活性保护效果。各体系的详细组成如表1所示。

表1　不同水分含量下胰岛素体系的组成（wt%）Table 1　The composition of the insulin system at different water content（wt%）for REMD simulation

采用GROMACS软件包［9］、Gromos96（53a6）［10］简化原子力场和REMD（Replica Exchange Molecular Dynamics）［11］方法在周期性边界为10nm×10nm×10nm的NVT系综中以2fs的步长进行分子模拟。首先将胰岛素分子置于周期性盒子中心，然后在胰岛素分子周围均匀添加保护剂和水分子。其中，水分子采用TIP4P模型。范德华分子间相互作用和静电相互作用的截距分别为1.4nm和1.0nm。并且每10步重建一次邻近列表。静电相互作用的远程修正采用PME（Particle Mesh Ewald）［12］方法。

各体系首先进行5500步的能量最小化，以优化体系结构。然后设定体系温度为300K，进行4ns的预平衡过程；预平衡结束后，再分别在280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308和310K这16种温度下进行10ns的平衡过程，从而获得各对应温度下稳定的胰岛素体系。最后，将各温度下平衡后的结构作为初始构象，再进行50ns的REMD模拟。以上模拟过程每2ps交换1次，取最终平衡后5ns的模拟轨迹用来进行数据统计和分析。

1.3冻干实验

运用冷冻干燥实验研究LEA-motif保护剂对猪胰岛素六聚体在冻干过程中的保护效果。制备实验用胰岛素浓度为5mg/mL，再加入LEA-motif保护剂，其与胰岛素六聚体的摩尔比分别为1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（即LEA-motif与胰岛素单体的摩尔比为1∶0、1∶6、1∶12、1∶18、1∶24，与分子模拟的量相匹配）。

采用冻干机进行冷冻干燥实验。首先将药物在-45℃预冻1h，从而完成冷冻过程；然后抽真空，一次干燥温度-35℃，干燥室内真空度为0mBar，干燥18h。解析干燥温度为25℃，直至干燥过程结束，这个过程共持续6h。冻干结束后，用橡皮塞封玻璃瓶，将冻干后的胰岛素保存于冰箱中。

1.4效价测定

用十八烷基硅烷键合硅胶做为填充剂（4.6mm× 250mm，5μm，Waters e2695）；以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7mL，乙醇胺调节pH至2.3，加水至1000mL）-乙腈（74∶26）为流动相；柱温为40℃；检测波长为214nm；流速1mL/min。冻干胰岛素固体用0.01mol/L盐酸溶液复溶，制成40U/mL的溶液，注入液相色谱仪20μL，记录色谱图；另取未冻干胰岛素原液适量为对照，同法测定，按外标法以峰面积计算效价［13］。

2　结果与分析

2.1干燥前后胰岛素三维结构的变化

在药物冻干实验中，干燥蛋白药物的水分含量一般要求在2%［14］左右。因此，我们重点分析水分含量在2%附近的胰岛素样品的干燥情况。没有添加任何保护剂和添加了一定量LEA-motif的干燥胰岛素的三维结构如图2所示。

从图2中的结果可以看出，没有LEA蛋白特征重复片段保护的胰岛素样品，干燥后，整体结构发生很大变化，许多疏水残基外翻暴露于胰岛素单体的分子表面，α-螺旋明显减少，并大部分转化为无规则卷曲和β-扭转，三维结构彻底变形，而且这种变性趋势随着干燥程度的增加而增加，这样严重变性的胰岛素即使在水溶液中也不可能恢复到初始三维活性结构。然而，添加保护剂的胰岛素的三维活性结构得到了较好的保持，从4种保护情况来看，添加6条LEA-motif保护剂，胰岛素三维活性结构也略微发生了变性，α-螺旋有所减少，这由于添加的保护剂数量不足，在干燥过程中无法使胰岛素得到很好的保护，但相对未加任何保护剂的胰岛素而言，添加6条LEA-motif对胰岛素活性结构有一定的保护效果。然而，添加12、18和24条LEA-motif保护剂，干燥后的胰岛素样品在整体结构和二级结构上都被保护的较好，尤其添加24条LEA-motif，其胰岛素活性结构与初始结构相比没有明显区别。从以上结果可以看出，LEA蛋白特征重复片段对胰岛素的生物活性保护是显而易见的。

图2　干燥后的胰岛素的三维结构比较Fig.2　3D structures of dried insulin

2.2胰岛素干燥前后的二级结构变化

图3中横坐标为添加了不同数目的LEA-motif保护剂的胰岛素和初始胰岛素模型，纵坐标为α-螺旋、β-转角、无规卷曲的数目。从图3中可以看出，未加任何保护剂的胰岛素α-螺旋数目（如图3A）显著减少，而β-转角却急剧增加（图3B），说明胰岛素二级结构在干燥过程中发生了严重变性，大部分α-螺旋转变成β-转角，胰岛素明显发生变形。然而，添加LEA-motif的胰岛素在干燥过程中α-螺旋的数目几乎保持不变，β-转角虽有增加，但明显低于未加任何保护剂的胰岛素体系（图3B），该结果与图2中的三维活性结构图一致。说明LEA-motif对胰岛素在干燥过程中的二级结构也有较好的保护效果。从图3可以看出，添加24条LEA-motif的胰岛素α-螺旋在不同水分含量下保持的最稳定，二级结构维持最佳。综合α-螺旋和β-转角数目的变化趋势图，随着干燥程度的增加，α-螺旋数目减少，而β-转角有所递增，说明胰岛素并不是越干越好，而是有一个最佳的水分含量范围。胰岛素的结构特点决定，如果偏离了这个水分含量，都会引起一定程度的变性。

图3　有/无LEAM保护下干燥的胰岛素中的二级结构变化柱状图Fig.3　Secondary structure of insulin with/without LEAM protectants

2.3胰岛素体系内的氢键分析

保护剂对蛋白药物的保护作用主要是通过分子间相互作用实现的。其中，氢键相互作用是主要的分子间相互作用。在干燥过程中，随着水分含量的减少，保护剂与胰岛素之间形成的氢键增多（图4A），说明LEA-motif能迅速适应缺水环境，形成适应胰岛蛋白的形状，较好地吸附在其表面，形成保护层，保护胰岛素不因缺水而受到伤害，很好地维持胰岛素的活性结构，这与水替代学说基本一致［15］。再者，蛋白质多肽主链中形成的氢键决定蛋白质的二级结构，有LEA-motif保护的胰岛素主链间的氢键数目相对比较稳定，且比未加任何保护剂的胰岛素主链间形成的氢键数目多（图4B），主链间稳定的氢键可以保护胰岛素的二级结构不被破坏，更说明LEA蛋白特征重复片段能维持三维结构的稳定性。

图4　胰岛素体系内氢键数目柱形图Fig.4　H-bonding number of insulin system

2.4效价分析

有文献［16］表明，胰岛素的效价测定可采用HPLC，通过峰面积计算得到。所以本文通过HPLC测定效价，从而分析胰岛素冻干前后的活性变化。

在分子模拟研究中，采用胰岛素单体，而在本验证实验中，采用猪胰岛素六聚体作为实验对象，研究LEA-motif在干燥过程中对胰岛素的保护效果。这主要是因为猪胰岛素在制备过程中，利用锌离子沉淀法使胰岛素形成六聚体，可避免胰岛素一定程度的失活，保证高产，然而，若模拟采用六聚体的话，体系分子量太大，且计算耗费时间太长。另外更重要的是，LEA-motif对胰岛素六聚体在冻干过程中的活性保护效果良好的话，那我们完全可以推论，LEA-motif对胰岛素单体有更好的保护效果，与模拟结果一致。

表2　不同浓度保护剂的热敏性药物胰岛素冻干前后生物活性变化情况Table 2　Results of potency of initial/dried insulin with/without LEA-motif

表2是未加保护剂的胰岛素六聚体和添加1、2、3、4条LEA-motif的胰岛素六聚体各体系（即胰岛素单体与LEA-motif的摩尔比分别为1∶6、1∶12、1∶18、1∶24，与模拟一致）的3次平行实验所得的峰面积和效价平均值，峰面积大小反应了胰岛素六聚体干燥后的活性结构保护效果。然后根据表3中的峰面积大小计算胰岛素在干燥前后的生物活性变化，如图5所示。

图5　添加LEAM的胰岛素与未加保护剂的胰岛素冻干后的活性变化Fig.5　Bioactivity of dried insulin with/without LEAM

从图5可知，冻干后胰岛素的效价均有所降低，说明胰岛素在冻干过程中，受温度和水分的影响，结构有轻微的变化。因为我们实验用的胰岛素是六聚体，与模拟采用的胰岛素单体不同，所以实验所用胰岛素在冻干前后的结构变化程度与模拟得到的结果有一定的区别，但是，从实验结果来看，胰岛素在冻干前后还是有一定的结构变化的。对于未加保护剂的胰岛素而言，模拟用的胰岛素单体在干燥前后结构有显著变化，活性完全丧失；在冻干实验中，未加保护剂的胰岛素冻干后效价降低了12%左右。然而，当添加了保护剂后，猪胰岛素的效价比明显提高了。这说明在冻干过程中，LEA-motif对胰岛素的保护效果是显而易见的。不论是对胰岛素六聚体还是单体，LEA-motif都体现出良好的保护效果。

另外，图中显示，随着LEA-motif浓度的增加，胰岛素的效价有增加趋势，当浓度达到1∶3条件下，胰岛素的效价达到最高，此后随着浓度的增加，胰岛素效价值趋于平稳。说明胰岛素进行冷冻干燥，并不是加越多的保护剂效果越好，应该适量的添加保护剂浓度，节约成本，并且又能很好地使胰岛素活性结构得到保护。

3　结论

从分子模拟分析结果可知，LEA-motif在干燥过程中能有效限制胰岛素的有害热运动，很好的保护其生物活性结构。并且添加保护剂的胰岛素的二级结构也得到了很好的保持，防止α-螺旋转化为β-转角及无规卷曲，说明添加保护剂的胰岛素具有较高的结构稳定性。这主要是由于随着水分含量的减少，LEA-motif逐渐取代水分子与胰岛素形成氢键，形成适应胰岛蛋白的形状，吸附在胰岛素表面，形成保护层，防止疏水基团外翻，保护了胰岛素的活性结构。氢键及静电相互作用对胰岛素结构的稳定性起到了非常重要的作用。另外，从效价测定实验也可以看出，与未加保护剂的胰岛素相比，有LEA-motif保护的胰岛素六聚体冻干后活性更好，更说明LEA-motif确实对胰岛素具有良好的保护效果。总之，LEA-motif是一种有效的冻干保护剂。

［1］王思玲，苏德森，顾学裘.口服胰岛素制剂的研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2000，17（2）：143-146.

［2］张敬如，黄复生，王昆.蛋白质药品的真空冷冻干燥技术及研究进展［J］.中国药业，2006，15（13）：25-27.

［3］Tunnacliffe A，Wise M J.The continuing conundrum of the LEA proteins［J］.Naturwissenschaften，2007，94（10）：791-812.

［4］Browne J，Tunnacliffe A，Burnell A.Anhydrobiosis：plant desiccation gene found in a nematode［J］.Nature，2002，416：38.

［5］Daixi Li，Baolin Liu，Baisong Guo，et al.Investigation on bioactive protection of LEA protein to insulin by molecular simulation［J］.Molecular Simulation，2013，39（2）：160-168.

［6］李代禧，张燕，刘宝林，等.氨基酸对胰岛素单体活性结构的干燥保护作用［J］.计算机与应用化学，2012，29：111-115.

［7］Shimizu T，Kanamori Y，Furuki T，et al.Desiccation-induced Structuralization and glass formation of group 3 late embryogenesis abundant protein model peptides［J］.Biochemistry，2010，49：1093-1104.

［8］DaixiL，XiaomingH.Desiccationinducedstructural alterations in a 66-amino acid fragment of an anhydrobiotic nematodelateembryogenesisabundant（LEA） protein［J］. Biomacromolecules，2009，10（6）：1469-1477.

［9］Van Der Spoel D，Lindahl E，Hess B，et al.GROMACS：Fast，flexible，and free［J］.Journal of Computational Chemistry，2005，26（16）：1701-1718.

［10］Stocker U，van Gunsteren W F.Molecular dynamics simulation of hen egg white lysozyme：a test of the GROMOS96 force field against nuclear magnetic resonance data［J］.Proteins，2000，40（1）：145-153.

［11］Zhou R.Replica exchange molecular dynamics method for protein folding simulation［J］.Methods in Molecular Biology，2007，350：205-223.

［12］Abraham M J，Gready J E.Optimization of parameters for molecular dynamics simulation using smooth particle-mesh Ewald in GROMACS 4.5［J］.Journal of Computational Chemistry，2011，32（9）：2031-2040.

［13］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：845-846.

［14］华泽钊.冷冻干燥新技术［M］.北京：科学出版社，2005：380.

［15］Golovinan E A，Golovin A，Hoekstra F A，et al.Water replacement hypothesis in atomic details：Effect of trehalose on the structure of single dehydrated POPC bilayers［J］.Langmuir，2010，26（13）：11118-11126.

［16］Emami J，Hamishehkar H，Najafabadi A R，et al.A novel approach to prepare insulin-loaded poly（Lactic-Co-Glycolic Acid）microcapsules and the protein stability study［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98（5）：1712-1731.

Investigation on bioactive protection of LEA-motif to insulin during desiccation

ZHANG Yan1，LI Dai-xi1，*，GUO Bai-song2，ZHAI Zhen1，LIU Li1，YANG Chun-sheng2，YU Hua-xing1
（1.Institute of Food Science and Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China；2.Lyophilization Lab，Shanghai Tofflon Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201108，China）

In the paper，insulin was taken as the model of heat-sensitive drugs，and LEA-motif as the bioactive protectant.Gromacs software with Gromos96（53a6）forcefield was adopted to investigate the LEA-motif protective effects on insulin by REMD molecular simulation method.Results showed a significant protective effect on 3D structure and secondary structure of insulin with the presence of LEA-motif.In addition，the potency experiment by HPLC showed the bioactivity of the rehydrated insulin with LEA-motif was higher than that of the rehydrated insulin without any protectant.In a word，LEA-motif had shown its great application value as a drying protectant for heat-sensitive protein drugs.

insulin；LEA-motif；molecular simulation；bioactive protection of desiccation；structure stability；potency

TS201.2

A

1002-0306（2015）02-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.029

2014－04－14

张燕（1988-），女，硕士研究生，研究方向：热敏性药物的冻干保护。

李代禧（1975-），男，博士，副教授，研究方向：计算生物学。

国家自然科学基金（51076108）；上海市国际合作项目（12430702000）；上海市自然科学基金（12ZR1420400）；上海市联盟计划项目及上海市重点学科项目（T0503和P0502）。