超高压处理对冷却牛肉色泽稳定性的影响

王　璐，韩衍青，杨伯冰，李兴民，徐宝才，戴瑞彤，*（.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京00083；.肉品加工与质量控制国家重点实验室，江苏雨润肉类产业集团有限公司，江苏南京004）

超高压处理对冷却牛肉色泽稳定性的影响

王璐1，韩衍青2，杨伯冰1，李兴民1，徐宝才2，戴瑞彤1，*
（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.肉品加工与质量控制国家重点实验室，江苏雨润肉类产业集团有限公司，江苏南京210041）

选取牛肉半腱肌为原料，研究室温条件下，常压以及200、400、600MPa超高压处理10min对牛肉色泽稳定性的影响，测定色差值、肌红蛋白含量、高铁肌红蛋白还原酶活性（MRA）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量、耗氧率（OCR）等指标。结果表明：高压处理后牛肉的L*值升高，a*、b*值降低，OCR降低。MRA在400MPa左右达到最高，削弱高铁肌红蛋白（MetMb）的积累，NADH含量与MRA相关。贮藏期间，各组MRA、NADH含量均降低，但高压处理组比对照组MetMb积累速度慢，说明高压处理虽然可使肉色变浅，但贮藏期间肉色稳定性提高。

超高压，肌红蛋白含量，高铁肌红蛋白还原酶活性，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量，耗氧率

超高压技术（high pressure processing，HPP）是指将食品原料包装后，密封于超高压容器中，以流动介质作为传压媒介，在高静压（通常为100～1000MPa）下加工一定时间，引起生物体高分子成分中的非共价键（氢键、离子键和疏水键等）的破坏或形成，并杀死食品中的微生物，从而达到食品灭菌、保藏和加工目的的一种方法。

颜色是肉制品最重要的指标之一，是消费者判断肉质的标准。放血充分的肌肉中，肌红蛋白是色素物质的主要成分，肌红蛋白3种形式脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白之间的转化赋予了肌肉不同的色调。普遍认为肉色的褐变是鲜红色的氧合肌红蛋白自动氧化生成暗褐色的高铁肌红蛋白所造成的，而肌细胞内部的高铁肌红蛋白还原酶可以将高铁肌红蛋白还原为肌红蛋白，从而稳定肉色。在一定条件下，超高压处理会对肉类颜色产生影响。马汉军等［1］研究发现，随着处理压力升高，牛肉L*增加，a*下降，b*基本不变；压力高于400MPa时L*保持稳定，a*下降速度减缓；高压处理使肌红蛋白总量降低，高铁肌红蛋白的比例在400MPa以上显著增加。Kathrine等［2］也有研究表明，300MPa以上压力处理猪背最长肌，a*显著下降，b*显著增加。鲤鱼和金枪鱼的研究中也得到类似结论［3］。超高压处理对肉色的影响是一个复杂的现象，还有待于进一步研究。目前对肉色的研究大多关注于色差值和肌红蛋白含量的变化，而高铁肌红蛋白还原酶系统对肉色的影响研究并不多。

本文主要研究了超高压处理后，牛肉色差值、肌红蛋白含量、高铁肌红蛋白还原酶活力、NADH含量、肌肉呼吸耗氧率等指标的变化，以探讨超高压处理对肉色稳定性的影响。尤其从高铁肌红蛋白还原酶系统方面进行分析整合，旨为后续相关性研究提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

牛肉半腱肌北京金五星交易市场；马心肌红蛋白美国Sigma公司；NADH、噻脞蓝、N-甲基-吩嗪甲基硫酸盐、乙醇脱氢酶、Tris北京索莱宝科技有限公司；其他试剂北京蓝弋试剂公司，均为分析纯。

HPP/15L/600MPa超高压设备包头科发高压科技有限责任公司；CR400色差仪日本柯尼卡—美能达公司；Evolution 60S紫外可见分光光度计北京益明德科技有限公司；TGL20M台式高速冷冻离心机盐城市凯特实验仪器有限公司；OXYGRAPH液相氧电极英国汉莎（Hansatech）公司。

1.2实验方法

1.2.1肉样的处理取新鲜牛肉半腱肌，去除可见脂肪和结缔组织，然后切分成厚1cm、约100g的肉块。将样品真空包装后置于压力处理釜中，设置200、400、600MPa三组压力处理，压力上升到设定目标后保压10min，施压环境为室温。高压处理样品与常压对照组均置于4℃冰箱中储存以备用，并考察其在1～5d贮藏期的变化。

1.2.2色差值的测定用色差仪直接测量样品亮度值L*、红度值a*、黄度值b*。

1.2.3肌红蛋白含量的测定按参考文献Tang［4］介绍的方法，略有改动。取5g肉样，加入25mL 0.04mol/L，pH6.8的磷酸盐缓冲液。室温下，10800r/min均质25s。置均质液于冰浴中1h，然后在8000r/min，4℃下离心15min，上清液用滤纸过滤。反应体系在分光光度计上扫描，波长分别为：582、557、525、503nm。脱氧肌红蛋白［DeoMb］、氧合肌红蛋白［OxyMb］和高铁肌红蛋白［MetMb］含量（单位%）的计算公式如下：

其中，R1=A582/A525，R2=A557/A525，R3=A503/A525；A582、A557、A525、A503分别表示在582、557、525、503nm下的吸光值。

1.2.4高铁肌红蛋白还原酶活力（MRA）测定

1.2.4.1MetMb及样品中粗酶液的提取参考Mikkelsen［5］介绍的方法。

1.2.4.2还原性测定按表1配制标准反应混合物，反应温度25℃，空白对照以水代替NADH，其他组分不变。反应由加入NADH起始，记录580nm下吸光值。MetMb还原酶活力用每毫升提取液在1min内在580nm下吸光值变化来表示。

表1　高铁肌红蛋白还原酶活力测定的标准反应混合物Table 1　Reaction substances of metmyoglobin reductase activity

1.2.5烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量测定参考孙京新［6］的方法，测定570nm处的吸光度，结果表示为nmol/g样品。

1.2.6耗氧率（OCR）测定依据Kaplan［7］的方法，使用OXYGRAPH液相氧电极进行耗氧率的测定。

1.2.7数据处理与分析每个实验三个平行，采用SPSS 17.0数据分析软件对各指标进行单因素方差分析。计算标准偏差（±SE）并进行差异显著性分析。

2　结果与讨论

表2　超高压处理对牛肉L*值的影响Table 2　The influence of high pressure process on L*value of beef

2.1超高压处理对牛肉色差值的影响

由表2知，随着压力增加，牛肉L*值升高，压力处理组显著高于对照组（p＜0.05）。这与大部分学者的研究结果一致［8-9］。随着贮藏天数增加，各组L*值均呈递增趋势，且随着压力增加，贮藏期间上升趋势变缓。

L*值增加可能是由于高压作用下肌红蛋白中的球蛋白变性或者亚铁血红素被取代或失去所造成的。另外，L*值的上升与肉的系水力降低有关，由于处理压力升高，肉样表面纤维结构更加疏松、汁液溶出量增加，水分附着在肉表面使肉的L*值增加［9］。

表3　超高压处理对牛肉a*值的影响Table 3　The influence of high pressure process on a*value of beef

由表3知，随着压力升高，牛肉的a*呈递减趋势，压力处理组之间差异显著（p＜0.05）。贮藏期间，各组a*均随时间呈下降趋势，这可能是MetMb随着时间积累的效果。5d内压力组a*值的降低显著低于对照组。

高压处理后a*的降低可能是由于亚铁肌红蛋白氧化而变成MetMb造成的［10］。Choi等［11］认为a*下降的原因是肌浆蛋白中的磷酸化酶b、肌酸激酶、磷酸丙糖异构酶和一种未知蛋白变性对肉的a*起到遮掩作用，因此影响了肉的a*和L*。Pinero等［12］研究发现在牛肉饼中添加适量β-葡聚糖可以抑制颜色变化。

表4为超高压处理对牛肉b*值的影响，随着压力升高，牛肉的b*值有降低的趋势，这种趋势在前2d并不明显，第3d以后，400MPa与600MPa与对照组相比b*显著降低（p＜0.05）。贮藏期间，b*的变化是波动的，但各组第5d的b*都比第1d要显著增加。

表4　超高压处理对牛肉b*值的影响Table 4　The influence of high pressure process on b*value of beef

现有研究中，也有发现b*值随着压力的作用而呈降低的趋势。Beltran等［13］将超高压作用于剁碎的鸡腿肉中观察到a*和b*值降低。李宗军等［14］发现，压力处理可引起猪肉饼L*、a*和b*值的变化，变化幅度与加压温度有关。

2.2超高压处理对牛肉肌红蛋白含量的影响

表5～表7分别是超高压处理对牛肉三种肌红蛋白含量的影响。由表可知，压力增加，MetMb含量先降低后升高，在400MPa时转折得到较低值。而OxyMb的变化正好与MetMb相反。DeoxyMb含量随着压力变化是波动的，无明显规律。

表5　超高压处理对牛肉MetMb含量的影响（%）Table 5　The influence of high pressure process on OxyMb of beef（%）

表6　超高压处理对牛肉OxyMb含量的影响（%）Table 6　The influence of high pressure process on OxyMb of beef（%）

表7　超高压处理对牛肉DeoxyMb含量的影响（%）Table 7　The influence of high pressure process on DeoxyMb of beef（%）

MetMb含量随着时间逐渐增加，MetMb的积累是由OxyMb不断氧化和高铁肌红蛋白还原酶系统对MetMb的还原共同作用的结果。分析5d内MetMb增加量发现，三个高压处理组相比对照组MetMb积累速度慢，贮藏期间颜色稳定性高于对照组，说明高压处理可以提高肉色稳定性。

适当的低压处理可以激活高铁肌红蛋白还原酶系统，还原已经形成的MetMb，而当压力过高时，则会破坏还原酶系统，还原反应也被抑制，从而使MetMb比例增加。Carlez等［15］报道在200～500MPa压力下，总的可提取的肌红蛋白下降，而MetMb在400～500MPa显著增加。

虽然高压处理生牛肉色泽有明显变化，但对熟牛肉制品色泽影响却很小，可能由于煮制过程中，肌红蛋白变成了亚硝基肌红蛋白，而这种蛋白不受压力和其他蛋白质凝胶的影响［16］，若压力处理前，采用NaNO2和NaCl对生肉进行腌制，所形成的亚硝基肌红蛋白对压力很稳定，就可以对色泽起到保护作用。

表8　超高压处理对牛肉高铁肌红蛋白还原酶活力的影响（nmolMMb reduced/min）Table 8　The influence of high pressure process on MRA of beef（nmolMMb reduced/min）

2.3超高压处理对牛肉高铁肌红蛋白还原酶活力（MRA）的影响

由表8知，随着压力升高，牛肉MRA值先升高而后迅速降低，各组之间差异显著（p＜0.05），且在400MPa左右出现转折点，得到最大值。多数研究表明，压力对酶活的影响主要分两个阶段：在较低压力下，酶活性中心凝聚，酶和基质的隔离状态被打破，酶和基质充分接触，酶活性上升；在较高压力下，酶蛋白的疏水键和离子键因体积缩小而断裂，酶的三级结构被破坏，活性中心丧失，酶活性下降。因此，推测在400MPa左右存在一个最适压力使高铁肌红蛋白还原酶活性达到最高。

贮藏期间，各组MRA都逐渐降低。一方面由于高铁肌红蛋白还原反应中的电子传递体和供体的减少，另一方面由于本实验测定MRA时添加了外源性NADH，MRA的降低很可能是冷藏期间高铁肌红蛋白还原酶变性引起的。

高铁肌红蛋白还原酶是高铁肌红蛋白还原酶系统中的关键酶，在NADH存在下，它可以有效地将MetMb（Fe3+）还原成二价（Fe2+）状态。高铁肌红蛋白还原酶活力是阻止MetMb积累的控制因子，高MRA可提高肉色稳定性。研究表明，色泽越稳定的肌肉，积累的MetMb量越少，这很可能是高铁肌红蛋白还原酶作用的结果。而在本实验中，MetMb含量和MRA的变化趋势刚好相反，体现了很好的负相关性，与前人报道的结果相符合。

表9　超高压处理对牛肉NADH含量的影响（nmol/g样品）Table 9　The influence of high pressure process on NADH of beef（nmol/g sample）

2.4超高压处理对牛肉NADH含量的影响

由表9知，加压过程中，NADH含量的变化趋势大体是先升高后回降，在400MPa左右出现拐点。这与MRA的变化是相对应的。在肌肉环境中，NADH是高铁肌红蛋白还原反应中的电子传递体和供体，NADH浓度与MRA活性呈极显著正相关性［17］。在贮藏过程中，各组的NADH含量随时间逐渐降低。

影响肉色的一个关键因素就是MetMb的还原，这需要NADH的协助。在一定程度上，它也制约了肉本身色素蛋白的还原能力，因为NADH含量很小而且其再生机制比较复杂，Bekhit等［18］研究表明NADH含量在稳定牛肉颜色以及高铁肌红蛋白酶还原活性上起到了很大作用。高铁肌红蛋白还原酶还原MetMb是依赖NADH存在的，然而NADH在宰后肉中含量是逐渐降低的，宰后7d很难再检测到NADH，因此宰后肉中MRA仍然保持一定水平，但肉色稳定性却难以维持。此外，一些研究还表明，乳酸脱氢酶与宰后NADH再生、MetMb的还原相关。这种机制是通过宰后注射乳酸盐产生的乳酸脱氢酶转化为丙酮酸盐和NADH，从而提高高铁肌红蛋白酶还原能力来实现的。

2.5超高压处理对牛肉耗氧率（OCR）的影响

由表10知，压力升高，耗氧率降低。这可能是由于在高压的挤压作用下，降低了肌肉组织间的氧分压。随着贮藏时间延长，各组耗氧率都呈持续下降趋势。三个高压处理组之间在第1d有差异显著，第2d开始200MPa与400MPa之间已无显著变化，第4d时三组均无显著差异。比较5d内耗氧率降低量可知，高压处理后能适当延缓贮藏期间耗氧率的降低。

耗氧率表征呼吸强度，呼吸代谢更强的肌肉耗氧率更高，呼吸强度高的肉颜色稳定性越差。耗氧率与MetMb积累速度呈显著正相关［19］；线粒体活性高，呼吸耗氧上升，进而降低了氧分压，促使DeoMb生成和积累，DeoMb稳定性差，更易被氧化成MetMb，使肉色变褐。

表10　超高压处理对牛肉耗氧率（OCR）的影响（nmol/（g meat·min））Table 10　The influence of high pressure process on OCR of beef（nmol/（g meat·min））

3　结论

牛肉经高压处理后，颜色淡化并变白，产生不利影响。压力增加，牛肉L*值升高，a*、b*值、OCR降低。MRA在400MPa左右达到最高，削弱MetMb积累。贮藏期间，高压处理组相比对照组MetMb积累速度慢，说明高压处理虽然使肉色变浅，但处理后贮藏期间肉色稳定性提高。因此后续生产应用中可在200～400MPa之间选取一个适宜压力，获取较高MRA，以保持牛肉较好的色泽，并抑制贮藏期间MetMb的积累。

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Effect of high pressure processing treatment on beef color stability

WANG Lu1，HAN Yan-qing2，YANG Bo-bing1，LI Xing-min1，XU Bao-cai2，DAI Rui-tong1，*
（1.College of Science and Nutrition Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China；2.State Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control，Jiangsu Yurun Meat Group Co.，Ltd.，Nanjing 210041，China）

Beef emitendinous muscle was used as material in this experiment，different pressures of HPP（0，200，400，600MPa）10min on beef color stability were analyzed.The results of beef color，myoglobin，Metmyoglobin reducing activity（MRA），NADH and oxygen consumption rate（OCR）showed as follows：as the pressure increased，L*value of beef increased，a*and b*value decreased，OCR was reduced.400MPa group had the highest MRA and slowest rate of MetMb accumulation comparing with other groups，NADH level was associated with the MRA.During storage，MRA，NADH content were gradually decreased in both control and HPP-treated groups，but the rate of MetMb accumulation in HPP-treated groups were slower than that of the control group，indicating that the HPP treatment could improve color stability.

HPP；myoglobin；MRA；the content of NADH；OCR

TS251.52

A

1002-0306（2015）02-0138-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.022

2014－05－07

王璐（1991-），女，硕士研究生，研究方向：肉制品贮藏保鲜理论与技术。

戴瑞彤（1966-），女，博士研究生，副教授，研究方向：肉品的贮藏保鲜技术研究。

科技部十二五科研项目（2012BAD28B02）。