穿心莲内酯干预对哮喘大鼠气道IL-33表达的影响

杨　勇　刘雅娟　程　立★

穿心莲内酯干预对哮喘大鼠气道IL-33表达的影响

杨勇刘雅娟程立★

目的 观察穿心莲内酯干预对哮喘大鼠气道IL-33表达的影响，探讨其作用机制。方法 SD大鼠36只随机分成3组：哮喘组、穿心莲内酯干预组和对照组，每组各12只。通过100mg卵清蛋白（OVA）腹腔注射致敏，并且OVA雾化吸入连续激发28d，末次激发24h后处死大鼠。行支气管灌洗液（BALF）细胞总数、嗜酸性粒细胞计数，AB-PAS染色观察气道组织杯状细胞、黏液分泌情况，Real-time PCR检测IL-33 mRNA在肺组织内的表达。结果 穿心莲内酯干预组BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞数、AB-PAS阳性染色面积、IL-33 mRNA表达均较哮喘组减低（P＜0.05）。结论 穿心莲内酯可抑制哮喘大鼠气道炎症，并且降低气道IL-33的表达。

哮喘 大鼠 穿心莲内酯

支气管哮喘（简称哮喘），是一种严重危害人类健康的气道慢性炎症性疾病［1］。有研究表明，肺组织中IL-33的表达与哮喘的严重程度呈正相关［2］。本资料自2014年3月至8月观察穿心莲内酯对哮喘大鼠气道炎症及IL-33表达的影响，从而为哮喘的药物治疗提供新的依据。

1　材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠（雌性）共36只，体重（200±20）g，周龄6～7周，武汉同济医学院实验动物中心提供。

1.2药品及实验试剂 穿心莲内酯注射液（江西青峰药业有限公司）；卵蛋白（Ⅴ级）（美国Sigma公司）；氢氧化铝凝胶（Invivogen公司）；RNAiso Reagent试剂（大连TaKaRa公司）；逆转录试剂盒（大连TaKaRa公司）；荧光试剂SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ（大连TaKaRa公司）；AB-PAS染色试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）。

1.3动物分组及模型建立 36只SD大鼠（按随机数字法）分为3组，每组12只，分别是哮喘组、穿心莲内酯干预组（干预组）和对照组。依据既往文献建立大鼠哮喘模型［3］：哮喘组和干预组在第1、8天通过腹腔注射致敏液1次（2ml生理盐水加入OVA 100mg和氢氧化铝200mg制成混合液），在第1次致敏后2周起用1%卵清蛋白（OVA）雾化激发，雾化1次/d，30min/次，连续激发28d。对照组用等量生理盐水溶液代替OVA处理。干预组在接受OVA雾化激发的同时，予以穿心莲内酯0.06mg/（g·d），腹腔注射给药28d。

1.4采集肺组织标本 末次激发24h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.05ml/10g）、固定并暴露腹腔，腹主动脉放血处死大鼠，打开胸腔，结扎右肺门的根部，取肺的右上叶和中叶放入冻存管中，立即液氮速冻，保存于-80 ℃的冰箱以备提取RNA，取右下叶肺组织放入4%的多聚甲醛中固定24h，制备成石蜡标本和石蜡切片，进行肺组织阿辛蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色。

1.5支气管灌洗液（BALF）细胞计数 取左肺，向肺内缓慢注入2ml生理盐水，保持30s后缓慢回抽灌洗液，共灌洗3次。取2mlBALF1500r/min离心10min，回收混悬液，用于细胞总数、嗜酸性粒细胞计数。

1.6实时荧光定量PCR （1）总RNA提取：采用RNAiso Plus试剂提取血清中的总RNA，用核酸蛋白测量仪测定RNA的纯度和浓度。（2）反转录：以RNA为模版，按PrimeScript RT reagent Kit操作说明进行反转录，反应体系20μl。（3）荧光定量PCR：根据Genbank中大鼠IL33、β-actin全基因序列，由TaKaRa公司设计和合成引物。IL-33上游5'-GAGACTCCGTTCTGGCCTCA-3'，下游5'-AATGTGTCAACAGACGCAGCAA-3'，扩增产物长度183bp；β-actin 内参引物扩增产物长度150bp。扩增条件为95℃ 30s 1个循环，95℃ 10s、61℃ 30s 40个循环，后接溶解曲线。（4）基因相对定量=2-△△CT，得各样本IL-33 mRNA的表达量。

1.7统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，进行单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1动物行为学观察 对照组大鼠呼吸节律正常，毛色较亮，体重正常增长，反应灵敏；哮喘组大鼠呼吸急促，腹肌抽搐，毛色失去光泽，四肢无力，反应迟钝、烦躁不安等反应。穿心莲内酯干预组：哮喘发作的程度明显缓解。

2.2气道上皮杯状细胞和黏液物质AB-PAS染色观察 对照组大鼠的气道上皮几乎未见杯状细胞，管腔内未见黏液分泌；哮喘组大鼠气道上皮可见大量紫红色杯状细胞，管腔内有大量蓝色或紫蓝色黏液分泌物，可见黏液栓形成，与对照组相比哮喘组气道上皮杯状细胞及黏液物质阳性相对着色面积明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。穿心莲内酯干预组阳性相对着色面积低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1～3。

图1　对照组气道组织AB-PAS×200

图2　哮喘组气道组织AB-PAS×200

图3　干预组气道组织AB-PAS×200

表1　各组大鼠气道上皮杯状细胞和黏液物质阳性相对着色面积的变化（x±s）

2.3BALF细胞总数和嗜酸性粒细胞分类计数 哮喘组中细胞总数及嗜酸性粒细胞绝对值、百分比均较对照组升高，穿心莲内酯干预后，可见明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　各组大鼠BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞分类计数的变化（x±s）

2.4肺组织IL-33 mRNA的相对表达量 哮喘组、干预组大鼠IL-33 mRNA的相对表达量较对照组增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预组大鼠IL-33 mRNA的相对表达量较哮喘降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3　各组大鼠肺组织IL-33 mRNA表达的变化（x±s）

3　讨论

穿心莲内酯是中药穿心莲的活性成分，可通过调节巨噬细胞表型分化及特异性抗原生成而有效调节固有免疫和适应性免疫反应，在体内外均具有较强的抗炎作用，可抑制TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的合成［4］。体外实验中，有效地抑制炎症细胞对 LTB4、PGE2及TXB2 的合成［5］。此外，穿心莲可抑制哮喘大鼠炎性细胞浸润，纠正失调的Th1/Th2平衡，达到抗炎症的作用［6］。

哮喘是由多种细胞包括气道的炎性细胞和结构细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病［7］。本实验通过OVA诱发制备哮喘大鼠模型，采用穿心莲内酯干预。结果显示，大鼠细胞总数、嗜酸性粒细胞百分数、嗜酸性粒细胞绝对值数较哮喘组降低（P＜0.05），与既往研究基本一致［8］；大鼠肺组织AB-PAS染色表明干预组上皮杯状细胞增生及黏液分泌较哮喘组降低（P＜0.05）。结果表明，穿心莲内酯可以有效抑制大鼠气道炎症、气道黏液高分泌，从而预防和缓解哮喘的症状。

IL-33是Th2型细胞因子，在哮喘患者和哮喘模型中表达增高，其不仅影响Th2细胞的分化，也直接作用于肥大细胞、DC细胞、嗜酸性粒细胞等诱导变态反应性炎症，因此，IL-33在哮喘的发生发展中发挥着重要作用［9］。麻晓燕等［10］通过观察哮喘患者血浆及痰液中IL-33的含量，发现支气管哮喘患者外周血中IL-33含量高于正常组，而且重度哮喘组高于轻、中度哮喘组，此外，痰液中嗜酸性粒细胞计数与痰中IL-33含量呈明显的正相关。本资料结果显示，哮喘组、干预组大鼠IL-33 mRNA的相对表达量较对照组增高（P＜0.05）；干预组大鼠IL-33 mRNA的表达量较哮喘降低（P＜0.05）。结果表明，IL-33在哮喘大鼠的肺组织中高表达，穿心莲内酯可以明显抑制哮喘组肺组织IL-33的表达及其介导的炎症反应。

综上所述，IL-33作为炎症因子参与哮喘的发生和发展，穿心莲内酯可以抑制大鼠气道炎症、气道黏液高分泌，同时降低肺组织中IL-33的表达，从而使哮喘得到控制。

1 Pearce N， Douwes J. The global epidemiology of asthma in children State of the Art Series. Asthma in high-and low-income countries，Edited by M. Chan-Yeung. Number 1 in the series. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease， 2006， 10（2）： 125～132.

2 Préfontaine D， Lajoie-Kadoch S， Foley S， et al. Increased expression of IL-33 in severe asthma： evidence of expression by airway smooth muscle cells. The Journal of Immunology， 2009， 183（8）： 5094～5103.

3 李承德， 周文宾， 孙艳， 等. 黄芪多糖对哮喘大鼠 Th17/Treg 细胞因子及肺部炎症的影响. 中国药理学通报， 2013， 29（9）： 1275～1278.

4 Wang W， Wang J， Dong S， et al. Immunomodulatory activity of andrographolide on macrophage activation and specific antibody response. Acta Pharmacologica Sinica， 2010， 31（2）： 191～201.

5 Chandrasekaran C V， Gupta A， Agarwal A. Effect of an extract of Andrographis paniculata leaves on inflammatory and allergic mediators in vitro. Journal of ethnopharmacology， 2010， 129（2）： 203～207.

6 王美怡， 李艳华， 金蓉， 等. 穿心莲内酯磺化物对支气管哮喘小鼠肺泡灌洗液炎性细胞， 白细胞介素-12 及白细胞介素-13 表达的影响. 实用儿科临床杂志， 2012， 27（21）： 1644～1646.

7 刘粉， 张才擎. 孟鲁司特对哮喘患者肺功能及炎症因子 IL-25， IL-33 的影响. 实用药物与临床， 2014， 17（8）：973～976.

8 李艳华， 王美怡， 金蓉， 等. 穿心莲内酯对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞表达的影响及其作用机制. 中国当代儿科杂志， 2012， 14（5）： 371-374.

9 谢莉，朱平.IL-33在免疫相关疾病中的研究进展.免疫学杂志， 2013，29（6）： 535～539.

10 麻晓燕，罗雅玲，邵金莲，等.支气管哮喘患者外周血，痰液中IL-33的含量及其相关性分析.第三军医大学学报，2011，33（14）： 1526～1529.

Object To evaluate the effect of andrographolide on expression of IL-33 in a rat model of asthma. Methods SD rats（n=36）were randomly divided into three groups：the normal group（n=12），the asthmatic group（n=12），the andrographolide intervention group（n=12）. The rats were sensitized by 100mg ovalbumin（OVA），then they were challenged with ovalbumin，24 hours after the fi nal inhalation and challenging，all the rats were sacrifi ced. The amount of total cells and the concentration of eosinophils in the bronchoalveolar lavage fl uid（BALF）of each group were determined，the metaplasia of goblet cells in airway wall along with the degree of mucus hypersecretion were observed by alcian blue/periodic acid schiff（AB-PAS）staining. The pulmonary expression of IL-33 mRNA were measured by real-time PCR. Results The amount of total cells，eosinophils in BALF，the airway infl ammatory pathological score，the goblet cells in the airway wall，the degree of mucus secretion，the level of IL-33 mRNA in andrographolide group were all signifi cantly lower than those in asthmatic group（P＜0.05）. Conclusion The andrographolide can suppress the airway infl ammation and decrease the expressions of IL-33.

Asthma Rat Andrographolide

442008 湖北医药学院附属东风医院综合医疗科