乙基紫探针共振瑞利散射法测定头孢硫脒

向术平， 孙芳芳， 许国萍， 江 虹*

(1.长江师范学院化学化工学院，重庆 408100；2.渝中区环保局，重庆 40400； 3.彭水环保局，重庆 409699)

头孢硫脒(CEFA)是我国自行研制并首先应用于临床的半合成头孢菌素。CEFA对革兰阳性菌和部分革兰阴性杆菌均有良好的抗菌活性，临床上主要用于敏感菌引起的各种感染，尤其适用于金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、表葡菌和肠球菌等革兰阳性球菌引起的各种中重度感染的治疗。由于抗生素的广泛使用，细菌与药物多次反复接触后敏感性降低，许多常用头孢菌素类药物疗效减弱，而CEFA因其自身独特的性质在临床上倍受重视。目前，测定CEFA的方法主要是高效液相色谱法[1 - 4]，也有荧光光度法[5]的报道。高效液相色谱法虽然灵敏度高，但仪器较昂贵不易普及。

本工作在稀NaOH 溶液中，以乙基紫(EV)作探针，用共振瑞利散射(RRS)技术，研究并建立了测定痕量CEFA的新方法，迄今未见文献报道。方法用于实际药物及人血液中CEFA含量的测定，样品加标回收率为 99.5%～101.8%，相对标准偏差(RSD)小于1.2%，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500型荧光分光光度计(日本，日立公司)，测定狭缝2.5 nm；pHS-3C型精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

头孢硫脒标准(CEFA，重庆药检所)溶液：储备液浓度47.26 mg/L，冰箱4 ℃保存，用时稀释10倍。乙基紫(EV，上海化学试剂公司分装厂)溶液：1.0×10-4mol/L。NaOH溶液：0.20 mol/L。Tris-HCl缓冲溶液：0.1 mol/L HCl和0.2 mol/L Tris混合，用酸度计调节，配成pH=3.0～9.8的系列缓冲溶液。所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

于10 mL具塞比色管中，加入一定量的4.73 mg/L CEFA标准溶液，1.0 mL 0.20 mol/L NaOH 溶液和 3.0 mL 1.0×10-4mol/L EV溶液，用二次蒸馏水稀至刻度，摇匀，15 min 后，以λex=λem=220 nm 在荧光分光光度计上进行同步扫描，得RRS光谱，在最大共振散射波长341 nm 处测定体系的RRS强度IRRS和试剂空白的散射强度I0，计算△IRRS=IRRS-I0。

2 结果与讨论

2.1 EV-CEFA的共振瑞利散射光谱

图1 乙基紫与头孢硫脒的共振瑞利散射光谱

按实验方法扫描CEFA标准溶液、EV溶液及CEFA-EV溶液。从图1可知，CEFA和EV自身的RRS均十分微弱(图中曲线1和2)，当在CEFA 的稀NaOH 溶液中加入EV后，CEFA结构中的羧酸根离子则与EV以静电引力和疏水作用力结合生成离子缔合物，使体系的RRS强度显著增强，其最大共振散射峰位于341 nm，在此波长下，CEFA在一定浓度范围内，随着其浓度的增加，体系的RRS强度呈线性下降(图中曲线4～7)，故可用于CEFA 的定量分析。

2.2 反应介质及用量的选择

考察了pH=3.0～9.8 的Tris-HCl缓冲溶液和0.20 mol/L NaOH 溶液对CEFA-EV体系△IRRS的影响。结果表明：用0.20 mol/L NaOH 溶液1.0 mL 有较好的效果，体系的灵敏度较高。实验选用1.0 mL 0.20 mol/L NaOH溶液。

2.3 EV溶液浓度的选择

考察了不同浓度的 EV 溶液对CEFA-EV体系△IRRS的影响。结果表明：EV浓度在(2.0～3.0)×10-5mol/L 时，体系的△IRRS较大，实验用1.0×104mol/L EV 溶液3.0 mL。

2.4 试剂加入顺序的选择

考察了EV、CEFA 和 NaOH 溶液在不同加入顺序时对体系△IRRS的影响。结果表明：以实验方法的加入顺序为最佳。

2.5 反应时间

在优化条件下，考察了不同反应时间对体系 △IRRS的影响，结果表明：缔合物在 15 min内即可形成，至少稳定1 h。实验选在 15 min后测定。

2.6 标准曲线及检出限

按实验方法配制标准系列溶液并在荧光光度计上扫描RRS光谱。在测定波长341 nm 下作 △IRRS-c标准曲线。线性回归方程为:△IRRS=-524.1-1964c(c:mg/L)，相关系数r=0.9988，线性范围为0.094～0.70 mg/L，检出限(3Sb/K)为0.075 mg/L。

2.7 方法的选择性

在选定条件下，考察了一些常见物质对测定 0.473 mg/L CEFA 的影响。结果表明，相对误差不大于±5% 时，以下共存物质(倍量)不干扰测定：葡萄糖、麦芽糖、D-果糖、D-木糖、L-赖氨酸、L-白氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、H2C2O4(200)；甘氨酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸、柠檬酸三钠、NaCl、KCl(100)；L-亮氨酸、氨基乙酸、D-甘露糖(80)；Na2SO4、K2SO4、Na2S2O3、KNO3、NH4NO3、Mg(NO3)2、Ba(NO3)2、Pb(NO3)2、Sr(NO3)2(50)；NaI、MnSO4、MgSO4、Fe2(SO4)3、CuCl2、CaCl2、SrCl2(20)；DL-苹果酸、尿素(10)。可见，方法具有良好的选择性。

2.8 样品分析

2.8.1药物分析取重庆市庆余堂制药有限公司注射用CEFA 1支，将内容物溶解后移入1 000 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀。取该液0.50 mL 于100 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀，即为CEFA 待测液。取待测液1.0 mL于10 mL 比色管中，按实验方法加入 NaOH 溶液和EV 溶液，并用水稀至刻度，再按实验方法测定样液中 CEFA 的含量，平行6份，同时作加标回收试验(n=6)，结果见表1。

2.8.2血液分析取人体血液样品(重庆涪陵中心医院提供)，以4 000 r/min 离心20 min，取上清液1.0 mL，加入 2.0 mL 甲醇，摇匀，离心分离 10 min，将离心液定容至25.0 mL。取该定容液 1.0 mL，用水稀释至100 mL，即得待测液。取待测液1.0 mL，按实验方法加入 NaOH溶液和EV溶液，测定血液样品中CEFA含量，平行测定6份，同时做加标回收试验，结果见表1。

表1 样品分析结果及回收试验 (n=6)

"ND":not detected.

3 结论

以乙基紫作探针，用共振瑞利散射技术可以测定人体血液和药物中痕量头孢硫脒的含量，方法准确、可靠，并有较高灵敏度和选择性。