同位素稀释气相色谱-三重四极杆质谱测定虾仁中氯霉素

曹艳平, 辛成龙, 季 萍

(山东大学预防医学研究院，山东省疾病预防控制中心,山东济南 250014)

氯霉素是一种广谱抗生素，由于其价格低廉且效果显著，因此在畜禽、水产养殖等方面有一定应用。但氯霉素存在严重的毒副作用，容易引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿灰色综合症等疾病，目前世界许多国家都禁止在食用动物饲养和治疗中使用氯霉素，其兽药残留最大限量(MRL)为“不得检出”，欧盟委员会决议(2003/181/EC)规定氯霉素的最低要求执行限量为0.3 μg/kg，其阳性结果必须经过质谱确证。常用的质谱法有气相色谱-质谱(GC/MS)[1 - 3]、液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)[3 - 8]。

本文建立了同位素稀释气相色谱-三重四极杆质谱法测定虾仁中氯霉素，方法采用多反应监测模式(MRM)，有效排除了复杂本底对检测结果的干扰，极大地提高了检测灵敏度。加入同位素内标物质以校准和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，采用反吹技术，无需净化，提高了分析结果的精密度和准确度。当称样量为5 g时，方法检出限(S/N≥3)为0.1 μg/kg ，可满足对氯霉素限量值的严格要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A/7000B气相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国，Agilent公司)；460/H超声波清洗器(德国,Elma)；HR2860搅拌机(荷兰，Philips)；N-EVAP112氮吹仪(美国,Organmation Associates公司)。

氯霉素标准品(含量98.5%)、氘代氯霉素(D5-CAP,100 ng/μL丙酮溶液)，均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH。氯霉素标准储备液：准确称取6.3400 mg氯霉素标准品，用甲醇定容于25 mL，得250 μg/mL储备液,贮存于冰箱，临用时用甲醇逐级稀释成0.25 μg/mL使用液。氘代氯霉素溶液：用甲醇稀释成1.0 μg/mL使用液。丙酮、乙酸乙酯、乙睛均为色谱纯，Fisher Scientific公司；正庚烷、甲醇为色谱纯级，Merck公司；N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)，Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器分析条件

色谱条件：HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent公司)；在进入质谱端口前，使用微板流路控制装置由超低死体积(Ultimate Union)吹扫连接一根未涂渍固定液的毛细管柱(1.5 m×0.18 mm)，其末端通入质谱检测器；载气：高纯氦气，流量1 mL/min；柱温：100 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至270 ℃，保持8 min ；反吹1.5 min ；进样口温度：250 ℃，不分流进样，进样量：1 μL。

质谱条件：离子源(EI)温度：250 ℃，电子轰击能量：70 eV,传输线温度：280 ℃，溶剂延迟时间：8 min。氯霉素分析参数如下：两个选择反应监测(SRM)通道：m/z225→208、m/z225→178，碰撞能量分别为5、10 eV；D5-氯霉素的SRM通道：m/z230→213、m/z230→183，碰撞能量分别为5、15 eV。

1.3 样品处理方法

称取粉碎后的样品5 g(精确到0.01 g),加内标氘代氯霉素使用溶液50 μL，以乙酸乙酯20.0 mL超声提取20 min，过滤，取10.0 mL滤液，60 ℃水浴氮气吹干，加0.5 mL甲醇、4 mL 1 mol/L NaCl溶液，超声1 min,以2 mL正己烷进行脱脂二次，用3 mL、2 mL乙酸乙酯提取水相，合并提取液，氮气吹干，待衍生。加入100 μL衍生剂 BSTFA+TMCS(99+1)，涡旋混合1 min，在70 ℃烘箱中加热30 min，氮气吹干，加入100 μL正庚烷，涡旋混合1 min，转移至带有100 μL玻璃插管的样品瓶中，进行GC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

氯霉素易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙睛等有机溶剂。本实验用乙酸乙酯对氯霉素进行加标回收实验(n=6)，加标10 ng的绝对回收率为80.1%，而乙睛为50.7%，因此用乙酸乙酯作为提取溶剂。用正己烷除去与氯霉素同时被提取的脂类物质，若有乳化现象，可进行离心使分层明显，弃去正己烷层。无需经过固相萃取柱净化，前处理过程简便有效快速，同时得到较高的回收率和重现性。

2.2 质谱分析条件的优化

图1为氯霉素衍生物全扫描质谱图，选择基峰m/z225为母离子，其子离子分别为m/z208、178，将碰撞能量设定为5、10、15、20、25、30 eV进行条件优化，结果最佳碰撞能量分别为5、10 eV。图2为D5-氯霉素衍生物全扫描质谱图，选择基峰m/z230为母离子，同样方法优化出最佳碰撞能量分别为5、15 eV。

图1 氯霉素衍生物的全扫描质谱图

图2 D5-氯霉素衍生物的全扫描质谱图

2.3 标准曲线和检出限

分别吸取0.25 μg/mL氯霉素标准溶液2、4、10、20、40、100 μL于3 mL离心管中作为标准系列，相当于测定液中氯霉素的质量分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 ng，分别加入25 μL内标溶液后进行测定；以氯霉素衍生物m/z225→208峰面积与D5-氯霉素衍生物m/z230→213峰面积比值(y)对氯霉素质量(x,ng)进行线性回归计算，回归方程为：y=7.79×10-3x+3.15×10-3(r=0.9991)。方法检出限(S/N≥3)为0.1 μg/kg。

2.4 回收实验与精密度

用未检出氯霉素残留的空白虾仁样品做加标回收实验(n=6)，内标加入量为25 ng,结果见表2

表2 氯霉素的加标回收率及精密度

2.5 净化效果比较

同一样品分别取二组(n=6)进行加标回收实验，均加标10 ng，一组采用本文建立的方法提取后未净化衍生测定，另外一组采用提取后C18固相萃取柱净化后衍生测定，两组的回收率无显著差异，对二组数据进行t检验，t=0.0725，查t界值表得t0.001，5(双侧)=6.869，因t0.001,在α=0.05水平处，两组无明显差异。

2.6 反吹的应用

采用反吹技术可以从色谱柱中除去高沸点物质，在目标化合物出峰后，将后流出的组分从进样口的分流放空口中反吹出去，使其不进入质谱检测器，反吹可降低化学噪音和分析时间，提高检测效率。实验连续测定120余份虾仁样品后，检测器等整个系统灵敏度未下降。

3 结论

采用气相色谱-三重四极杆质谱，以多反应监测模式测定氯霉素，降低了复杂本底对检测结果的干扰。方法样品处理简便、内标法定量准确，适合氯霉素的测定,采用反吹技术可降低化学噪音，有效保护质谱检测器。