固相萃取净化-高效液相色谱法测定食品中α-细辛醚和β-细辛醚残留量

彭 芳，雷美康，许菲菲，柴明青，祝子铜，徐倩倩，李 东，余 琪

（1.衢州出入境检验检疫局，浙江 衢州 324002；2.义乌出入境检验检疫局，浙江 义乌 322000）

固相萃取净化-高效液相色谱法测定食品中α-细辛醚和β-细辛醚残留量

彭 芳1，雷美康1，许菲菲2，柴明青2，祝子铜1，徐倩倩1，李 东1，余 琪1

（1.衢州出入境检验检疫局，浙江 衢州 324002；2.义乌出入境检验检疫局，浙江 义乌 322000）

建立用于测定乳粉、绿豆糕、猪肉、熏鱼肉、调味粉中白菖蒲油主要成分α-细辛醚和β-细辛醚含量的固相萃取-高效液相色谱分 析方法。选择乙腈提取样品中的细辛醚，提取液经硅胶固相萃取小柱净化，采用配备荧光检测器的高效液相色谱仪进行分离测定，外标 法定量。乳粉、绿豆糕、猪肉、熏鱼肉、调味粉中α-细辛醚和β-细辛醚的方法定量限均为0.01 m g/kg，在0.01～0.50 mg/kg的添加水平范围内，α-细辛醚的 平均回收率在78.2%～99.4%之间，β-细辛醚的平均回收率在80.8%～10 5.6%之间，相对标准偏差为1.6%～10.3%。该方法能够满足食品中细辛醚的痕量检测要求。

α-细辛醚；β-细辛醚；食品；固相萃取；高效液相色谱法

菖蒲作为药材在印度和埃及至少已有2 500 a的历史。我国《神农本草经》列为上品，使用也有2 000 a的历史。菖蒲作为一种补药和兴奋剂闻名已久，在欧洲和美国也广泛使用。它能增进食欲，改善消化功能而用于食物的烹调。其味苦、辛，有特殊的芳香气味，可用于肉类、禽类的卤制、酱制加工品。既有开胃、减轻肠气、缓解消化不良的作用，又有去腥去臭和增香增味的作用［1］。白菖蒲油是国际市场上重要的精品油之一，由天南星科植物白菖蒲的根茎经水蒸气蒸馏制得，为淡黄至淡褐色黏稠状挥发性精油，呈奶油似香气，略带苦辣味。欧洲、美洲的白菖蒲油在食品中，同小豆蔻油、独活油、生姜油等用于各种烹饪中。在含酒精饮料中可令饮料温暖辛香［1］。白菖蒲油的主要活性成分为α-细辛醚（又称α-细辛脑）和β-细辛醚（又称β-细辛脑）。美国食品药品监督管理局在1971年宣称白菖蒲油中的细辛醚具有致癌性，欧美等国家也因为白菖蒲油可能会对人体带来潜在的健康危害，对细辛醚的人体摄入量作出了严格限定。由消费者健康保护协会欧洲委员会食品科学委员会发布，2001年12月12日实施的《食品科学委员会对调味剂和其它食品配料中含β-细辛醚的评价》中明确提出β-细辛醚人最大日可摄取量为115 μg［2］。

目前α-细辛醚和β-细辛醚的检测方法主要集中在气相色谱法［3-4］、高效液相色谱法［5-18］和气相色谱-质谱法［19-20］，近年也发展起来液相色谱-质谱法［21-23］，但仅限于 测定药材、血浆及烟草中其含量，针对食品中细辛醚含量的检测目前尚未见报道。

本实验采用固相萃取-高效液相色谱法研究了5 种食品中α-细辛醚 和β-细辛醚残留的定性和定量分析方法，用乙腈提取样品中的细辛醚，离心，上清液减压蒸干后，正己烷溶解残渣，硅胶固相萃取小柱净化，采用配备荧光检测器的高效液相色谱进行分离测定，外标法定量。方法的灵敏度和准确性能够满足日常对食品中白菖蒲油有效成分α-细辛醚和β-细辛醚含量测定的需求。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

猪肉、熏鱼肉、绿豆糕、调料粉、乳粉来源于当地超市。

乙酸乙酯、乙腈、正己烷、甲醇（均为色谱纯）德国Meker公司；α-细辛醚（纯度≥98%） 中国食品药品检定研究院；β-细辛醚（纯度≥70%） 德国DR公司。

1.2仪器与设备

1200高效液相色谱仪（配荧光检测器、Silica硅胶固相萃取小柱（1 g，6 mL，使用前依次用5 mL乙酸乙酯、5 mL正己烷活化，保持柱体湿润）） 美国 Agilent公司；ROTAVAPOR R-210真 空旋转蒸发仪（配1 00 mL鸡心瓶） 瑞士Büchi公司；Biofuge Primor离心机（不低于4 000 r/min） 美国Thermo公司。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

标准储备液的配制：准确称取适量的细辛醚标准品，用甲醇溶解配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，该溶液配制于棕色容量瓶中，-18 ℃以下避光保存；标准中间溶液的配制：用甲醇将标准储备液逐级稀释至1.0 μg/mL。该溶液配制于棕色容量瓶 中，-18 ℃以下避光保存。标准工作溶液的配制：根据需要，临用时吸取一定量的标准中间溶液，用甲醇配制成适当质量浓度的混合标准工作溶液，在0～4 ℃避光冷藏保存；水为超纯水。

1.3.2提取

准确称取5 g试样（精确到0.01 g）置于50 mL具塞离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋振荡3 min，以4 000 r/min离心5 min，将上清液转移至鸡心瓶中，再用20 mL乙腈重复上述提取步骤，合并提取液。在45 ℃减压旋转蒸发浓缩至干，加入3 mL正己烷，涡旋振荡溶解，待净化。

1.3.3净化

将待净 化溶液转移至 固相萃取柱中，用3 mL正己烷冲洗鸡心瓶，洗液上柱淋洗，弃去淋洗液，用8 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液至上述鸡心瓶中，在 45 ℃减压旋转蒸发浓缩至干，用2 mL甲醇溶解残渣，溶解液过0.45 μm有机系微孔滤膜过滤，待测。

1.3.4色 谱分析条件

Ag ilent XCB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；激发波长：265 nm；发射波长：365 nm；柱温30 ℃；流动相：甲醇-水（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

2　结果与分析

2.1提取溶剂的选择

α-细辛醚和β-细辛醚可溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯。本实验采用甲醇、乙腈和乙酸乙酯提取，结果表明三者均有满意的回收率，但经过实验发现乙酸乙酯、甲醇提取的杂质较乙腈多，特别是油状物的杂质，为下一步净化带来困难，因此本实验选用乙腈作为提取溶剂。

2.2净化方法的选择

固相萃取净化方法是复杂基质中痕量检测常用的净化方法。本实验根据α-细辛醚和β-细辛醚的极性大小等理化性质，研究了C18、HLB、弗罗里硅土和硅胶4 种固相萃取方法的净化效果，在上样溶剂的选择上，分别比较乙腈、甲醇、甲醇-水混合体系、乙酸乙酯和正己烷；在洗脱溶剂的选择上，分别比较了乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙酸乙酯-正己烷混合体系的回收率和净化效果。经过实验对比，选择硅胶固相萃取小柱净化，正己烷作为上样液，乙酸乙酯作为洗脱液的固相萃取净化方法，去除杂质干扰效果好，简便快捷，具有良好的色谱保留，回收率稳定。

2.3色谱条件的优化

对α-细辛醚和β-细辛醚标准溶液检测波长进行扫描，固定激发波长257 nm，对发射波长进行扫描，得到最大发射波长为365 nm；固定发射波长为365 nm，对激发波长进行扫描得到最大激发波长为265 nm。因此确定激发波长为265 nm，发射波长为365 nm。实验采用Agilent XCB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，甲醇-水，乙腈-水作为流动相比对分离效果，结果表明，2 种色谱柱和2 种流动相都能得到满意的效果。考虑到成本，本实验选择Agilent XCB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，甲醇-水（60∶40，V/V）作为流动相，30 ℃作为参考色谱条件。在上述色谱条件下，α-细辛醚和β-细辛醚的保留时间分别约为14 min和12 min，见图1。

图 11 α--细辛醚和β-细辛醚标准品的液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of α-asarone and β-asarone standards

2.4标准曲线、线性关系及方法定量限

用甲醇配成α-细辛醚和β-细辛醚质量浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L和2.5 mg/L的混合标准工作液。仪器响应峰面积Y对应细辛醚质量浓度X进行线性回归，2 种细辛醚的线性关系良好，见表1。以实际检测时的信噪比（RSN＞10）确定方法定量限，猪肉、熏鱼肉、绿豆糕、调料粉、乳粉中的α-细辛醚和β-细辛醚含量的方法定量限均为0.01 mg/kg。

表1　-细辛醚和-细辛醚的回归方程、相关系数和线性范围Table 1 Regression equations with correlation coeffifi cients and linear ranges for -asarone and -asarone

2.5实验室内回收率和精密度

表2　空白样品添加细辛醚的回收率及精密度（n=6）Table 2 Recoveries and precision of asarones in blank samples （n= 6）

采用标准添加法，在空白样品中添加3 个水平的细辛醚标准工作溶液，每个添加水平平行测定6次，测定结果见表2。结果表明，在0.01～0.50 mg/kg的添加水平范围内，α-细辛醚的平均回收率在78.2%～99.4%之间，β-细辛醚的平均回收率在80.8%～105.6%之间，相对标准偏差为1.6%～10.3%，满足日常检测需要。

3　结 论

本实验建立了用于检测乳粉、绿豆糕、猪肉、熏鱼肉、调味粉等食品中白菖蒲油主要成分α-细辛醚和β-细辛醚含量的固相萃取-高效液相色谱分析方法。选择乙腈提取样品中的细辛醚，提取液经硅胶固相萃取小柱净化，采用配备荧光检测器的高效液相色谱仪进行分离测定，外标法定量。该方法具有操作简便、灵敏、准确的优点，可用于乳粉、绿豆糕、猪肉、熏鱼肉、调味粉等中的α-细辛醚和β-细辛醚残留的定性和定量分析。

［1］ 张卫明， 肖正春. 中国辛香料植物资源开发与利用［M］. 南京： 东南大学出版社， 2007： 117-118.

［2］ 石琛， 方永奇. 细辛醚的研究进展［J］. 中医药学刊， 2006， 24（7）：1285-1286.

［3］ 魏立平， 昊玫涵. 用气相色谱法同时测定石菖蒲挥发油中α-细辛醚和β-细辛醚的含量［J］. 解放军药学学报， 2005， 21（1）： 62-64.

［4］ 贺凌云， 吴建平， 刘文芳. 毛细管气相色谱法测定细辛脑及有关物质［J］. 分析试验室， 2007， 26（10）： 84-87.

［5］ 柯雪红， 魏刚， 方永奇. HPLC测定石菖蒲药材中β-细辛醚、α-细辛醚的含量［J］. 中成药， 2002， 24（10）： 791-792.

［6］ 柯雪红， 方永奇. RP-HPLC测定石菖蒲、水菖蒲药材中β-细辛醚、α-细辛醚的含量［J］. 中国中药杂志， 2004， 29（3）： 279-280.

［7］ WIDMER V， SCHIBLI A， REICH E. Quantitative determination of beta-asarone in calamus by high-performance thin-layer chromatography［J］. Journal of A OAC International， 2005， 88（5）：1562-1567.

［8］ 吴建平， 贺凌云. 反相高效液相色谱法测定α-细辛脑的含量及有关物质［J］. 药物分析杂志， 2007， 27（3）： 364-366.

［9］ 李少刚， 郭欢， 郭小青. HPLC法检测细辛脑注射液的有关物质［J］.临床药学， 2008， 17（10）： 850-851.

［10］ 崔凌云， 于翠霞， 余潜， 等. 高效液相荧光色谱法测定人血浆中细辛脑的浓度［J］. 中国药师， 2008， 11（6）： 669-672.

［11］ 郑厚林， 陈阳建. HPLC法测定宁心益智胶囊中β-细辛醚和α-细辛醚的含量［J］. 中国药师， 2011， 14（10）： 1473-1474.

［12］ 王莹， 侯林， 陈智， 等. 高效液相色谱法测定石菖蒲挥发油中β-细辛醚的含量［J］. 食品与药品， 2011， 13（7）： 274-276.

［13］ 刘柳芳， 魏刚， 张琼丹， 等. 含石菖蒲复方煎剂中β-细辛醚的含量测定研究［J］. 中药新药与临床药理， 2012， 23（2）： 194-197.

［14］ 柯雪红， 方永奇. HPLC法测定神昌丸中β-细辛醚的含量［J］. 中国实验方剂学杂志， 2004， 10（4）： 15-17.

［15］ 刘眷海， 刘西京， 杨华生. 石菖蒲挥发油的GC-MS分析［J］. 中医药学刊， 2006， 24（7）： 1280-1281.

［16］ 严全鸿， 饶春意. 高效液相色谱法测定参杞益脑胶囊中β-细辛醚的含量［J］. 时珍国医国药， 2008， 19（9）： 2222-2223.

［17］ 张会宗， 刘晶， 邸子真， 等. 高效液相色谱法测定细辛属药材中α-细辛醚含量［J］. 医药导报， 2009， 28（9）： 1349-1351.

［18］ 王晓丽， 徐天娇， 孙辑凯， 等. 高效液相法测石菖蒲环糊精包合片中β-细辛醚的含量［J］. 齐齐哈尔医学院学报， 2014， 35（6）： 858-859.

［19］ 陈泽彬， 陈日来， 陈连剑， 等. 小儿遗尿分散片中α-细辛醚的含量测定［J］. 中国现代药物应用， 2010， 4（11）： 1-2.

［20］ 吴达， 张怡春. YC/T 361—2010 烟用添加剂β-细辛醚的测定： 气相色谱-质谱联用法［S］. 北京： 中国标准出版社， 2010.

［21］ 陈伟， 刘玉玲， 贺玖明， 等. 液相色谱-串联质谱法测定兔血浆中α-细辛脑的浓度［J］. 药物分析杂志， 2006， 26（10）： 1364-1368 .

［22］ NANDAKUMAR S， MENON S， SHAILAJAN S. A rapid HPLCESI-MS/MS method for determination of β-asarone， a potential antiepileptic agent， in plasma after oral administration of Acorus calamus extract to rats［J］. Journal of Biomedical Chromatography， 2012， 27（3）：318-326.

［23］ 刘莉， 周世玉. 超高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用法检测癫痫平片中β-细辛醚含量［J］. 中国药业， 2012， 21（20）： 44-45.

Determination of α-asarone and β-asarone Residues in Foods by Solid Phases Extraction-Liquid Chromatography

PENG Fang1， LEI Meikang1， XU Feifei2， CHAI Mingqing2， ZHU Zitong1， XU Qianqian1， LI Dong1， YU Qi1
（1. Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ， Quzhou 324002， China；2. Yiwu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yiwu 322000， China）

A sens itive and selective method was developed for the determination of residues of α-asarone a nd β-asarone as the main components of calamus oil in milk powder， mung bean cake， pork， smoked fi sh， and seasoning powder. The residues of α-asarone and β-asarone in the test samples were extracted with acetonitrile. The extract was cleaned up with a silica gel solid phase extraction column， analyzed by high performance liquid chromat ography （HPLC） equipped with a fl uorescence detector， and quantifi ed by external standard method. Milk powder， green bean cake， pork， smoked fi sh and seasoning powder were chosen as the representative samples. The limit of quantifi cation （LOQ） （RSN＞ 10） was 0.01 mg/kg in al l these sample s. The average recoveries of α-asarone and β-asarone at three spiked levels （0.01， 0.05 and 0.50 mg/kg）ranged from 78.2% to 99.4% and 80.8% to 105.6%， respectively， with rela tive st andard deviations （RSDs） between 1.6% and 10.3%. The method can meet the analytical requirements for trac e asarones in foods.

α-asarone； β-asarone； food； solid phase extraction （SPE）； high performance liquid chromatography （HPLC）

O657.63

A

1002-6630（2015）18-0190-03

10.7506/spkx1002-6630-201518035

2014-10-22

国家出入境检验检疫行业标准制修订项目（2009B527）

彭芳（1982—），女，工程师，硕士，研究方向为食品检验。E-mail：vivian_pf@126.com