基于抗氧化活性的丹参药品质量评价研究

贾 巧， 陈 华， 赵荣华， 任小姗， 夏之宁

（重庆大学化学化工学院，重庆　400044）

基于抗氧化活性的丹参药品质量评价研究

贾 巧， 陈 华*， 赵荣华， 任小姗， 夏之宁

（重庆大学化学化工学院，重庆400044）

目的 提出从抗氧化能力评价药物质量的新观点。方法 采用Luminol-Fe2+-H2O2流动注射化学发光体系评价了3种抗氧化剂单体和8种丹参药品的抗氧化能力，以药物对羟自由基的清除率对浓度作多项式四阶拟合，由拟合方程计算出各自IC50值，以IC50值表示自由基清除能力，从而直接反应8种丹参药品的抗氧化能力。结果 该方法有较好的稳定性和精密度，峰面积的RSD分别为2.3%和3.2%。抗氧化单体和丹参各种药品都表现为低浓度下羟自由基清除率与浓度成正比，高浓度则不然。结论 该方法简单，高效，重复性好，稳定性高。可推广应用于各抗氧化型药物的质量的实际疗效的初步评价。

抗氧化能力；质量评价；丹参药品；羟自由基；化学发光

氧自由基是生物体新陈代谢的中间产物［1］，活性比分子态氧高很多［2］。正常情况下，体内自由基的产生和清除是平衡的，但当生物体长期处于各种胁迫状态下，氧自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，体内氧自由基代谢出现失衡［3］，过多的活性氧可以引发膜脂质过氧化、蛋白质的损伤、嘌呤氧化、碱基突变、DNA链的断裂和突变［4］等，继而引起细胞凋亡、组织坏死甚至机体死亡［5］。目前已证实与自由基相关的疾病有炎症、心血管疾病、衰老［6］、帕金森氏病［7］、肿瘤、缺血性疾病、中毒和放射性疾病［8］等。

丹参是治疗心脑血管疾病的传统中药材，其治疗心脑血管疾病的作用与其含抗氧化活性成分有关，主要是通过清除已产生的自由基和阻断自由基链反应从而保护心脏免受伤害［9］。大量研究表明丹参在多方面具有较强的抗氧化活性，在治疗活性氧诱发的心脑血管疾病方面具有显著的疗效［10］。

传统的药物质量的好坏是采用其中所含的某一种或某一类有效成分的多少进行评价的［11］，该方法的缺点是与药物的实际治疗效果脱节。药物疗效与药效成分含有量固然有关，但不一定是正相关，含有量高不一定疗效就好，有时还会出现相反的情况。丹参药物在治疗心脑血管疾病，发挥疗效的过程中受多方面因素的影响，最根本的因素还是与药物本身清除致病因子或修复损伤的能力有关［12］。丹参药物对氧自由基的清除能力能直接反应对心脑血管疾病的治疗效果。本实验欲从其抗氧化能力方面对系列丹参药品的质量进行评价，建立抗氧化型药物质量评价的新方法和新思路。

1　仪器与试药

1.1仪器 IFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）；KQ-100型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGC-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DELTA 320 pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2药品与试剂 Luminol、儿茶素、丹参素钠、绿原酸、杨梅素，均为Sigma公司产品（纯度≧98%），无水乙醇、过氧化氢、FeSO4·7H2O、Na2CO3、NaHCO3均为国产分析纯，实验用水都为去离子水。8种丹参药品采购自重庆市某药店，厂家和生产批次信息列于表1。

表1　丹参系列药物信息

2　实验方法

2.1化学发光检测条件 光电倍增管负高压600 V，增益为1，管路内径0.8 mm，主副泵转速40 r/min相当于2.27 mL/min的体积流量，采样时间1 s。

2.2溶液配制 0.025 mmol/L的Luminol用0.1 mol/L碳酸盐缓冲溶液（pH 10.50）配制；0.048%的H2O2用去离子水配制；10 mmol/L Fe2+，加入少量铁粉和稀硫酸，临用时用去离子水稀释到0.02 mmol/L。

2.3样品前处理 准确称取丹参药品0.5 g，用50%乙醇溶解，超声30 min后放置室温后定容到50 mL量瓶。将样品溶液在5 000 r/min下高速离心10min取上清液作样品待测溶液。

将药物溶液稀释成一系列浓度，分别测定其·OH清除率，把清除率对浓度作非线性回归拟合，得到两者的量效关系，求出当清除率为50%时对应的浓度，即为各自的IC50值。IC50越小说明其抗氧化能力越强。

3　结果与讨论

3.1流动注射化学发光法参数优化

3.1.1流路的选择 考察了两种流路对抗氧化剂抗氧化能力评价的影响（图1）。流路A可从谱图上直接反应出抗氧化剂清除·OH的程度，但溶剂空白亦可使发光降低50%左右，会掩盖抗氧化剂的信号峰，使抗氧化剂的自由基清除率为负值，表观显示为促氧化作用，与实际相矛盾。Katerina等［14］对此现象进行了系统研究，但未能解决溶剂倒峰的现象。流路B则可避免这种现象，因此后续实验中选择流路B的混合模式。

图1　化学发光流路图

3.1.2Luminol浓度的选择 用单因素变量法，考察了Luminol浓度在0.001～0.030 mmol/L之间对发光强度、峰形、峰面积的影响。结果显示发光强度随浓度的增大而增大，但噪声亦同时增大，发光试剂残留也增多，峰对称性也变差。综合考虑各种因素，最终确定Luminol浓度为0.025 mmol/L。

3.1.3H2O2质量分数的选择 同样又考察了H2O2在0.030%～0.060%之间的发光情况。结果显示随H2O2质量分数的增大，发光强度先增加后减小，在H2O2为0.048%时峰形好，峰面积最大，且噪声也小。因此选择H2O2的使用液质量分数为0.048%。

3.1.4Fe2+浓度的选择 Fe2+是Fenten反应中的催化剂，一般催化剂具有用量少，高效率的特点。但Fe2+在碱性条件下不能稳定存在，容易被水中溶解氧化生成氢氧化铁红色沉淀，附着在管道内壁，堵塞管道。因而铁浓度不能过高。考察了浓度在0.020～0.100 mmol/L之间的Fe2+对发光情况的影响。结果显示Fe2+浓度对发光强度影响很小，因此本实验选用0.02 mmol/L Fe2+作为使用液。

3.1.5pH的选择 Luminol须在碱性条件下发光，但Fe2+在碱性条件下不稳定，因此考察了不同pH缓冲溶液的发光情况。结果发光强度随着pH的增大先增大后减小。在pH为10.50时达到最大值，故本实验选用缓冲溶液pH 10.50。

3.1.6体积流量的选择 实验考察了泵转速在10～70 r/min相当于体积流量0.57～3.99 mL/min下的化学发光情况。结果显示：低体积流量时由于纵向扩散导致峰展宽。高体积流量下反应量加大，峰高增高，峰形变好，如图2。但反应体系流过检测窗口的速度过快，反应不充分，在发光强度还未达到峰值时，液流已经流过检测窗，因而峰宽变窄，峰面积减小。综合考虑峰形、峰宽、峰面积，本实验选择主副泵同步转速40 r/min，体积流量为2.28 mL/min。

图2　不同体积流量的化学发光动力学曲线

3.1.7稳定性试验和精密度试验 在选定最优实验条件和最佳仪器参数后对发光体系的稳定性进行了考察。每隔2 h测定1次，共测定1 d内5个时间段内的空白发光强度，每次平行测5次。计算其相对标准偏差，峰高的RSD为1.5%，峰面积的RSD为2.3%，结果表明在1 d内该发光体系稳定。为了考察所建立体系的重复性，重复11次测定空白发光强度，计算其峰高、峰面积的RSD分别为3.4%和3.2%。结果表明测量结果的重复性良好。

3.2抗氧化剂单体的抗氧化能力评价 为考察方法测定结果的准确性和可靠性，实验选择了丹参素钠、儿茶素、绿原酸3种抗氧化剂单体的不同质量浓度对·OH的清除作用，以清除率y对质量浓度x作多项式4阶拟合，结果如表2所示。

表2　抗氧化剂单体的标准曲线拟合

结果表明，抗氧化剂的抗氧化能力与其含有量并非呈正比。根据拟合曲线，计算获得了各自的IC50值，IC50值越小表示其抗氧化能力越强，3种抗氧化剂的抗氧化能力大小依次为儿茶素＞丹参素钠＞绿原酸。酚类化合物抗氧化活性大小通常与分子中羟基的个数和位置相关。尤其是苯环上的羟基，由于氧的电子与芳香环电子共轭的影响，对氢离子的束缚能力减弱，相对容易给出氢离子自身被氧化成醌而具有较强的还原性，而脂肪链上的羟基则被氧化为醛、酮或羧酸。此外，分子内氢键越多，抗氧化活性越强［15］，试验测定结果与理论相吻合，说明该方法测定结果可靠，可应用于后续试验研究。

3.3丹参药品的抗氧化能力评价

3.3.1样品清除率比较 分别取各样品溶液用50%乙醇稀释50倍后成200 mg/L的质量浓度，以50%乙醇做空白对照，按照“3.1”项所示的方法测定清除率。测定结果如表3所示。

表3　高质量浓度（200 mg/L）下各丹参药品的自由基清除率比较（%）

从表3可以看出8种丹参药物在质量浓度为200 mg/L时都具有较高的羟自由基清除率，其中6#样品清除率达到99%，其清除率大小依次为6#＞7#＞3#＞8#＞1#＞2#＞4#＞5#。

3.3.2样品IC50比较 根据药物清除率能力差异选择不同质量浓度范围对样品进行稀释，测定各自清除率，清除率对质量浓度的拟合方程如表4所示。计算各自IC50值亦如表4所示，IC50大小依次为3#＜6#＜1#＜2#＜7#＜8#＜4#＜5#，即抗氧化能力顺序为3#＞6#＞1#＞2#＞7#＞8#＞4#＞5#。

表4　丹参药物清除率y-质量浓度x曲线拟合和IC50值

样品的清除率排序与抗氧化能力排序差别的原因正是因为高质量浓度下抗氧化剂抗氧化能力与质量浓度之间不呈正比关系。而对于一个确定的体系而言，IC50值是一个定值，与抗氧化剂的质量浓度无关。因此建议此类型实验都采用IC50值来表示抗氧化能力大小。

4　结论

建立了评价丹参药品抗氧化能力的流动注射化学发光法，对该发光体系进行各种参数优化，考察了方法的重复性和稳定性。该方法简单、高效、快速、精密度高、稳定性好。将该方法应用于3种抗氧化剂单体和8种丹参药品的抗氧化能力评价，结果表明低质量浓度下抗氧化剂的自由基清除率与质量浓度成正比，高质量浓度则不然。把清除率对质量浓度作多项式4阶拟合时，曲线拟合度良好。3种抗氧剂的抗氧化能力大小依次为儿茶素＞丹参素钠＞绿原酸。8种丹参药物的抗氧化能力大小依次为3#＞6#＞1#＞2#＞7#＞8#＞4#＞5#。

化学发光法最大优点是不需要光源，操作成本低，适合于抗氧化型药物的抗氧化能力效果的总体评价。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0667-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.048

2014-01-09

国家自然科学基金（21005092）；科技部国际合作计划项目（2010DFA32680）

贾 巧（1988—），女，硕士，从事天然产物活性成分筛选。Tel：18227678557，E-mail：missjia880519@163.com

陈 华 Tel：（023）65106615，E-mail：chenhuacqu@aliyun.com