艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞的增殖抑制作用及其机制

陈 军， 武延庆， 姚 莉

（兰州大学第二医院药学部，甘肃　兰州　730030）

艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞的增殖抑制作用及其机制

陈 军， 武延庆， 姚 莉*

（兰州大学第二医院药学部，甘肃兰州730030）

目的 研究艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法 采用巯基罗丹明B（SRB）法检测艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞的抑制率，流式细胞术检测细胞周期和凋亡，Hoechst33258荧光染色法观察细胞核形态的变化，免疫印迹法（Western blot）检测ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3的表达。结果 艾迪注射液作用24 h和48 h均对肺癌SPC-A-1细胞增殖具有显著的抑制作用（P＜0.01，P＜0.001）；与对照组相比，艾迪注射液作用48 h后G2/M期细胞比例增加（P＜0.001），G0/G1期和S期细胞比例下降（P＜0.01，P＜0.05），细胞凋亡率升高（P＜0.01）；同时细胞中ERK1/2磷酸化水平降低（P＜0.01），caspase-9及caspase-3表达增强（P＜0.05，P＜0.05）。结论 艾迪注射液能够通过阻滞细胞G2/M期和诱导凋亡作用抑制肺癌SPC-A-1细胞增殖，其机制与降低ERK1/2磷酸化水平和增加caspases-9及caspase-3活性有关。

艾迪注射液；SPC-A-1；周期；凋亡；ERK1/2；caspase

艾迪注射液是由斑蝥、人参、黄芪及刺五加提取制成的抗肿瘤中药注射液，目前已广泛用于原发性肝癌，肺癌，消化道肿瘤及妇科恶性肿瘤等的治疗［1-3］。体外研究显示，它对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用［4-7］，但尚未见艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞作用的报道，本实验旨在观察艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞增殖的影响，并对其机制进行初步探讨。

1　材料与方法

1.1细胞系 人肺癌SPC-A-1细胞购自中科院细胞库（上海），采用含有10%优级胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，培养条件为5%CO2、37℃。

1.2药品及试剂 艾迪注射液（批号20130317，贵州益佰制药股份有限公司）；RPMI-1640培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；巯基罗丹明B蛋白染料（SRB，美国Sigma公司）；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒及细胞凋亡荧光Hoechst33258检测试剂盒购自碧云天生物技术有限责任公司；Phospho-p44/42 MAPK（ERK1/2）rabbitmAb（美国Cell Signaling公司）；caspase-9及caspase-3抗体（美国Santa Cruz公司）；β-Actin（美国Sigma公司）。

1.3仪器 二氧化碳培养箱（美国SIM公司）；尼康80i荧光显微镜（日本Nikon公司）；Spectra Mr型全波长酶标仪（美国DYNEX公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4方法

1.4.1SRB法检测SPC-A-1细胞增殖抑制率 实验分艾迪注射液处理组和对照组，根据文献［8］选用艾迪注射液质量浓度依次为10、20、40、80、100 mg/mL，每组设3个复孔。取对数生长期SPC-A-1细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释为单细胞悬液，并以8×103个/孔接种于96孔细胞培养板中。24 h后艾迪注射液处理组分别加入经培养基稀释成不同质量浓度的艾迪注射液；对照组则加入等体积的培养基。5% CO2，37℃孵育24 h或48 h后每孔加入预冷的50%TCA溶液50μL，4℃固定1 h，去离子水洗涤5次，晾干；每个孔加0.4%SRB染色液50μL，常温下避光染色10～15 min，1%冰醋酸溶液洗涤5次，晾干，加入150μL 10 mmol/L的非缓冲Tris碱溶液，振摇溶解并混匀。酶标仪515 nm波长处测定吸光度（OD）值并计算各组的增殖抑制率。所有试验均重复4次。

1.4.2流式细胞术检测SPC-A-1细胞周期和凋亡 实验分为对照组，艾迪高质量浓度组（100 mg/mL），中质量浓度组（50 mg/mL）和低质量浓度组（10 mg/mL）。取对数生长期SPC-A-1细胞接种于6孔板中，5%CO2，37℃孵育48 h后，消化细胞，吹打成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，预冷的PBS洗涤2次，根据细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒操作说明书采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。

1.4.3Hoechst33258荧光染色法观察细胞核的变化 实验分组同“1.4.2”项。取对数生长期SPC-A-1细胞接种于6孔板中，5%CO2，37℃孵育48 h，收集细胞并制成合适浓度的细胞悬液，根据Hoechst 33258荧光染色说明书进行染色，并在荧光显微镜下观察细胞核的形态和荧光的强弱，采集图像。该方法观察细胞凋亡时，正常细胞核呈微弱的蓝色荧光，凋亡细胞则呈明亮蓝光，并伴有细胞核呈碎块状致密浓染。

1.4.4Western blot检测ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3的表达 实验分组同“1.4.2”项。取对数生长期的SPC-A-1细胞接种于6孔板中，药物作用48 h，弃去6孔板中旧的培养液，后加入适量RIPA细胞裂解液（含4%蛋白酶抑制剂和10%磷酸酶抑制剂）冰上裂解30min，离心（12 000 r/min，4℃）15 min，取上清。BCA法对样品中总蛋白进行定量，规定上样量为30μg。p-ERK1/2抗体1∶1 000稀释，caspase-9和caspase-3抗体1∶500稀释，4℃过夜，加入二抗（1∶1 000稀释）室温孵育2 h，ECL法显色。采用软件Image pro plus V 7.0分析条带的积分光密度。

2　结果

2.1艾迪注射液对SPC-A-1肺癌细胞的增殖抑制作用 从表1中可以看到，加入药物作用24、48 h后，不同质量浓度的艾迪注射液均对SPC-A-1肺癌细胞的增殖有显著的抑制作用（P＜0.01，P＜0.01），并且呈明显的时间和质量浓度依赖性（P＜0.05，P＜0.05），两者之间没有交互作用（P＞0.05），即表明艾迪注射对SPC-A-1肺癌细胞的作用时间和作用质量浓度两者之间没有协同效应。艾迪注射液作用24 h的IC50值是78.47 mg/mL，48 h的IC50值是63.23 mg/mL。

表1　艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞增殖的影响（±s，n=4）

表1　艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞增殖的影响（±s，n=4）

与对照组比较，*P＜0.01，**P＜0.01，***P＜0.001

组别抑制率/% 24 h 48 h对照组00艾迪10 mg/mL组8.24±0.68 14.30±3.01*艾迪20 mg/mL组16.90±4.47 25.35±5.57**艾迪40 mg/mL组39.09±3.21**42.01±11.21**艾迪80 mg/mL组46.90±8.44***51.31±14.01***艾迪100 mg/mL组56.33±10.07***62.50±9.87***

2.2艾迪注射液对SPC-A-1细胞周期和凋亡率的影响 如表2所示，艾迪注射液作用48 h后，与对照组比较，G0/ G1期、S期细胞比例下降（P＜0.01，P＜0.05），G2/M期细胞比例增加（P＜0.001），细胞凋亡率明显升高（P＜0.01），表明艾迪注射液可将SPC-A-1细胞周期阻滞于G2/ M期并诱导期产生凋亡效应。

表2　艾迪注射液对SPC-A-1细胞周期和凋亡率的影响（±s，n=4）

表2　艾迪注射液对SPC-A-1细胞周期和凋亡率的影响（±s，n=4）

注：与对照组比较，*P＜0.01，**P＜0.01，***P＜0.001

组 别细胞周期/% G0/G1S G2/M凋亡率/%对照组50.53±0.86 31.62±0.47 17.88±0.47 9.25±1.56艾迪10 mg/mL组47.50±0.79**30.49±1.05 22.02±1.95***24.64±0.90**艾迪50 mg/mL组47.05±0.45***29.52±1.14*23.46±0.84***28.70±2.20**艾迪100 mg/mL组45.98±0.84***28.95±1.24*25.12±0.57***30.24±0.66**

2.3艾迪注射液对SPC-A-1细胞核形态的影响 如图1所示，经Hoechst33258荧光染色后，对照组的细胞核呈正常均匀微弱的蓝色荧光，艾迪注射液处理组细胞则呈明亮蓝光，并伴有细胞核破碎致密浓染。并且随着艾迪注射液质量浓度的增加，细胞核蓝色荧光逐渐增强，并且细胞核破碎也更加明显。

2.4艾迪注射液对SPC-A-1细胞ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3表达的影响 如图2所示，不同质量浓度的艾迪注射液作用48 h后，和对照组相比，SPC-A-1细胞中ERK1/2蛋白磷酸化水平显著下降（P＜0.01），并呈浓度依赖性。50 mg/mL和100 mg/mL艾迪注射液作用48 h后，SPC-A-1细胞中caspase-9，caspase-3蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.05），但10 mg/mL艾迪注射液对caspase-9和caspase-3的表达均没有明显影响（P＞0.05）。

3　讨论

肺癌是全球范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤，对其的治疗一直备受关注［9］。艾迪注射液作为一种复方抗肿瘤中药制剂已广泛用于临床，尤其是用于肺癌的治疗已取得良好效果。大量临床报道显示［10-15］，艾迪注射液单独使用或联合放化疗对多种肺癌起到治疗或放化疗增效作用。体外研究显示，艾迪注射液能够通过多种机制抑制多种肺癌细胞增殖从而发挥其抗肺癌作用［4-7］。

本实验观察了艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞增殖的影响，结果发现艾迪注射液对肺癌SPC-A-1细胞的增殖具有显著的抑制作用，同时，对其作用机制进行了研究，流式细胞术结果显示，艾迪注射液能够明显诱导SPC-A-1细胞G2/M期阻滞并引起细胞凋亡率升高。众所周知，细胞周期G2/M期转换在细胞周期进展及凋亡启动中扮演着非常重要的作用。细胞在从G2期过渡至M期时需经过G2期检测点检查DNA复制的完整性及正确性，若G2期DNA损伤检查点的延迟增加，将直接诱导细胞凋亡［16］。因此，人们常通过G2/M期阻滞方法来促进细胞凋亡，而G2/M期阻滞已成为抗肿瘤药物的主要研究方向之一。本课题组认为，SPC-A-1细胞凋亡率增加正是由于艾迪注射液对G2/M期的阻滞作用引起的。为了进一步证实艾迪注射液对SPCA-1细胞凋亡的影响，本实验采用Hoechst 33258荧光染色实验观察艾迪注射液对SPC-A-1细胞核形态的影响，结果发现艾迪注射液能够引起细胞核蓝色荧光增强和细胞核破碎增加，这些结果与流式检测结果相符，进一步说明艾迪注射液能诱导SPC-A-1细胞发生凋亡。

图1　艾迪注射液对SPC-A-1细胞核形态的影响

图2　艾迪注射液对SPC-A-1细胞ERK1/2磷酸化，caspase-9及caspase-3的表达的影响（±s，n=4）

细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）常以磷酸化的活化方式广泛参与细胞的增殖、分化、细胞存活等多种生物化学反应，对肿瘤的发展、预防和治疗等都有重要的作用［17］。本实验观察了艾迪注射液对ERK1/2磷酸化水平的影响，结果发现艾迪注射液能够下调SPC-A-1细胞ERK1/2磷酸化水平，这就提示艾迪注射液可能通过直接抑制ERK信号通路实现对SPC-A-1细胞的增殖抑制作用。半胱天冬氨酸蛋白酶（caspases）在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用。细胞凋亡的过程实际上是caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，在人体细胞中，caspases的超表达和激活均可引起细胞的凋亡［18］。其中caspases-9和caspase-3被认为是caspase依赖凋亡途径中最关键的两个因子。一般认为caspases-9可与细胞色素形成复合物被激活并进一步激活细胞凋亡过程中最关键酶caspase-3从而触发凋亡级联反应［19］。结合本实验结果，50～100 mg/mL艾迪注射液能剂量依赖性上调caspases-9及caspase-3的表达，因此，不妨认为艾迪注射液能够通过调节caspases-9及caspase-3活性而诱导细胞凋亡。

通过干扰细胞周期进程抑制肿瘤细胞的增殖或（和）诱导肿瘤细胞凋亡是目前大多数肿瘤化疗药物发挥抗肿瘤作用的主要机制［20］。结合本研究结果，我们不妨认为艾迪注射液对SPC-A-1细胞的增殖抑制作用是通过阻滞细胞周期和诱导凋亡实现的，其机制可能与通过抑制ERK1/2蛋白磷酸化水平、上调caspases-9及caspase-3表达有关。该研究为艾迪注射液抗肺癌临床应用提供了进一步的实验依据。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0630-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.037

2014-02-01

陈 军（1969—），男，主管药师。Tel：（0931）8942791，E-mail：lzuchenj@163.com

姚 莉（1971—），女，副主任药师。Tel：（0931）8942407，E-mail：yaoli71@sina.com