荷丹片对APOE-/-小鼠血脂、炎症因子及形态学变化的影响

周玉娟， 于柏青， 刘春颖， 刘子豪

（1.河北大学基础医学院药理教研室，河北　保定　071000；2.河北大学研究生学院，河北　保定　071000；3.河北大学临床学院，河北　保定　071000）

荷丹片对APOE-/-小鼠血脂、炎症因子及形态学变化的影响

周玉娟1， 于柏青2， 刘春颖1， 刘子豪3

（1.河北大学基础医学院药理教研室，河北保定071000；2.河北大学研究生学院，河北保定071000；3.河北大学临床学院，河北保定071000）

目的 研究荷丹片（荷叶，丹参，山楂，番泻叶，补骨脂）对载脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠的血脂、脂联素、肿瘤坏死因子（TNF-α）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）和形态学变化的影响。方法 将50只APOE-/-小鼠随机分为对照组、模型组、荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组。对照组普通饲料喂养，其余各组高胆固醇饲料喂养。12周后，取血清测血脂，ELISA法测脂联素、TNF-α、hs-CRP水平；取同部位主动脉HE染色光镜下观察形态学变化。结果 与对照组相比，模型组血脂、TNF-α、hs-CRP水平明显升高（P＜0.01），脂联素水平明显降低（P＜0.01），主动脉形态学病变加重。与模型组相比，荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组的血脂、TNF-α、hs-CRP水平明显降低（P＜0.01），脂联素水平明显升高（P＜0.05），主动脉形态学病变有所减轻。结论 荷丹片可降低APOE-/-小鼠血脂和TNF-α、hs-CRP水平，升高脂联素水平，从而抑制动脉粥样硬化的发生、发展。

荷丹片；动脉粥样硬化；载脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠；血脂；脂联素；TNF-α；hs-CRP；形态学变化

动脉粥样硬化（atherosclerosis）是心血管病和脑血管病的主要形式，在全球死亡率最高［1］。而其重要的发病学理论是炎症学说，脂联素、TNF-α、高敏C反应蛋白（hs-CRP）在动脉粥样硬化发生发展的炎症过程中起着重要作用。从中医角度讲，动脉粥样硬化的病理性质多为瘀毒阻于脉络，即瘀毒阻脉是动脉粥样硬化的病机关键。荷丹片是一种复方调脂中药，具有升清降浊，补益肝肾，化痰祛瘀的作用。本研究选用荷丹片（荷叶，丹参，山楂，番泻叶，补骨脂），观察其对载脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠血脂、脂联素、TNF-α、hs-CRP以及主动脉形态学的影响，来探讨荷丹片对APOE-/-小鼠动脉粥样硬化干预作用及其机制。

1　材料与方法

1.1实验动物 50只8周龄健康清洁级APOE-/-小鼠（C57BL/6J背景），雌雄各半，平均体质量为（18.46±1.66）g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，实验动物合格证编号为：SCXK（京）2013-0002。

1.2实验药物及试剂 荷丹片（南昌济顺制药有限公司，批号20130306）；辛伐他汀片（山东方明药业集团股份有限公司，批号1301033）；胆固醇（赛尔克生物公司，批号130101）；中性甲醛固定液（河北大学基础医学院药理学研究生实验室配制）；TC、TG、HDL-C、LDL-C试剂盒（浙江东瓯生物工程有限公司）；脂联素、TNF-α、hs-CRP试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3实验仪器 TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV-2000分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；ZHWY-110X恒温水浴箱（上海智域分析仪器制造有限公司）；BCD-252NJV冰箱（苏州三星电子）；KD-BM生物包埋机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；LEICA RM2126切片机（上海莱卡仪器有限公司）；OlympusBX50光学显微镜（日本Olympus公司）；Model680酶标仪（美国BIO-RAD公司）。

1.4实验方法

1.4.1模型制备 50只小鼠随机分为对照组、模型组、荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组，每组10只。适应性喂养1周后，对照组正常饲料喂养，其余各组均高胆固醇（1.25%胆固醇）繁殖饲料喂养［2］建立动脉粥样硬化模型。荷丹片低、高剂量组分别灌胃0.65 g/（kg·d）、2.60 g/（kg·d）荷丹片，辛伐他汀组灌胃6 mg/（kg·d）辛伐他汀。对照组、模型组每日灌胃等体积生理盐水，每周称定体质量调整剂量，共12周。

1.4.2取材 12周末小鼠空腹12 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，分离血清，-20℃保存用于血清学分析。分离主动脉，置于4℃冰盐水中冲洗。在相同部位取一段长约1 cm的主动脉，于4%中性甲醛中固定，常规石蜡包埋，自主动脉根部向下行连续切片，厚5μm，HE染色。

1.4.3检测项目及方法 光学显微镜下观察主动脉形态学变化；比色法测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平；ELISA法测定血清脂联素、TNF-α、hs-CRP水平。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5统计学方法 采用SPSS 16.0软件处理，所有数据以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析的方法，以P＜0.05为差异有显著性；两两组间比较，方差齐采用LSD方法，方差不齐则采用DunnettT3方法，以P＜0.05为差异有显著性。

2　结果

2.1荷丹片对APOE-/-小鼠血脂的影响 与对照组相比，模型组TC、TG、LDL-C水平明显升高（P＜0.01），HDL-C水平明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组血清TC、TG、LDL-C明显降低（P＜0.01，P＜0.05），HDL-C显著升高（P＜0.01）；与辛伐他汀组相比，荷丹片低剂量组TC、TG水平明显升高（P＜0.01），LDL-C、HDL-C与之无显著差异（P＞0.05）。荷丹片高剂量组与之无显著差异（P＞0.05）。见表1。

表1　荷丹片对APOE-/-小鼠血脂的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of Hedan Tablets on serum lipid of APOE-/-m ice（±s，n=10）

表1　荷丹片对APOE-/-小鼠血脂的影响（±s，n=10）Tab.1 Effects of Hedan Tablets on serum lipid of APOE-/-m ice（±s，n=10）

注：与对照组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05；与辛伐他汀组比较，#P＜0.05

组别动物/只TC/（mmol·L-1）TG/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）HDL-C/（mmol·L-1）对照组10 11.09±1.40 0.95±0.08 7.43±1.26 1.71±0.43模型组10 22.13±2.61△1.39±0.15△14.01±2.49△0.94±0.19△荷丹片低剂量组10 16.81±1.43*#1.12±0.11*#10.22±2.60*1.51±0.31*荷丹片高剂量组10 13.13±1.85*0.97±0.07*8.25±1.36*1.76±0.35*辛伐他汀组10 12.80±1.67*0.99±0.08*7.82±1.20*1.72±0.25*

2.2荷丹片对APOE-/-小鼠血清脂联素、TNF-α、hs-CRP的影响 与对照组相比，模型组TNF-α、hs-CRP水平明显升高（P＜0.01），脂联素水平明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组TNF-α、hs-CRP水平明显降低（P＜0.01），脂联素水平明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；与辛伐他汀组相比，荷丹片低剂量组TNF-α、hs-CRP水平明显升高（P＜0.01，P＜0.05），脂联素水平明显降低（P＜0.05）。荷丹片高剂量组与之无显著差异（P＞0.05）。见表2。

表2　荷丹片对APOE-/-小鼠血清脂联素、TNF-α、hs-CRP的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Hedan Tablets on adiponectin，TNF-α，hs-CRP of APOE-/-m ice（±s，n=10）

表2　荷丹片对APOE-/-小鼠血清脂联素、TNF-α、hs-CRP的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Hedan Tablets on adiponectin，TNF-α，hs-CRP of APOE-/-m ice（±s，n=10）

注：与对照组相比，△P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05；与辛伐他汀组相比，#P＜0.05

组别动物/只脂联素/（ng·mL-1）TNF-α/（pg·mL-1）hs-CRP/（mg·mL-1）对照组10 851.08±38.92 285.85±27.30 2.62±0.37模型组10 784.86±36.10△396.10±36.94△3.47±0.28△荷丹片低剂量组10 821.06±28.21*#334.08±37.48*#2.96±0.30*#荷丹片高剂量组10 850.26±39.68*289.54±14.23*2.66±0.18*辛伐他汀组10 859.07±47.03*278.58±21.26*2.64±0.24*

2.3荷丹片对APOE-/-小鼠形态学的影响 对照组血管内膜轻度增厚，内皮不光滑，可见少量泡沫细胞，中膜平滑肌细胞排列紊乱，平滑肌细胞向内皮下迁移。模型组动脉内膜明显增厚，管腔狭窄，为粥样斑块期病变。纤维帽下为大量粉染的无定形物质（细胞外脂质和坏死细胞）和针状空隙（胆固醇结晶）。斑块内有大量的泡沫细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞。斑块处中膜内靠近内弹性膜的细胞长轴垂直于内膜，受累的中膜空泡变性。荷丹片低剂量组血管内膜增厚，内皮不光滑，斑块内有大量泡沫细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞。斑块受累的中膜空泡变性，平滑肌排列紊乱。荷丹片高剂量组和辛伐他汀组均较模型组、荷丹片低剂量组明显好转，血管内膜增厚，斑块内有泡沫细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞，中膜平滑肌细胞排列紊乱。见图1。

3　讨论

APOE-/-小鼠因apoE失效使得LDL、VLDL/ IDL等不能与相关受体识别结合，以致这些脂蛋白清除延缓而出现高脂血症［3］。APOE-/-小鼠斑块分布及病理特征与人类动脉粥样硬化斑块很相似，因此APOE-/-小鼠是研究动脉粥样硬化病程及干预效果的较理想的动物模型［4］。已有研究证明荷丹片能调节血脂［5］、抗氧化应激［6］从而发挥抗动脉粥样硬化作用，本实验以升清降浊、补益肝肾、化痰祛瘀为原则选用荷丹片，研究其是否通过对APOE-/-小鼠血脂及脂联素、TNF-α、hs-CRP的影响，进而发挥抗动脉粥样硬化作用。

图1　各组小鼠动脉病理切片（HE染色，×100）Fig.1 Pathological sections of aorta in Hedan Tablets groups and Simvastatin group（HE stain，×100）

脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。研究发现，健康的中年个体中，脂联素浓度与冠状动脉内膜增厚呈负相关。与无临床事件的患者比，患有冠状动脉疾病的个体脂联素水平更低［7］。脂联素能特异性地抑制TNF-α诱导ⅠκB-α-NF-κB通路的激活［8］。NF-κB的激活诱导细胞粘附分子，如ICAM-1，E-选择素，VCAM-1，进而招募白细胞参与炎症反应［9-10］。白细胞的异常黏附血管壁对动脉粥样硬化的发展至关重要［9］。因此，脂联素能通过抑制NF-κB通路抑制黏附因子的表达，是动脉粥样硬化发展进程中内皮炎症反应的重要调节因子。Ouchi等［11］的研究表明脂联素可能通过抑制巨噬细胞A类清道夫受体（MSR）的表达来担当泡沫细胞形成的负分泌调节器，从而抑制巨噬细胞转化成泡沫细胞。临床研究［12］也发现，脂联素可能通过减少TNF-α的生成从而抑制CRP、IL-6的表达，因此有助于减弱炎症反应。

TNF-α是一种主要由单核/巨噬细胞产生的细胞因子，参与机体的急、慢性炎症过程。近年来研究发现，TNF-α在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用，TNF-α等炎症介质可增强LDL与内皮细胞的黏附结合，促进LDL受体基因的表达，抑制脂蛋白酶的活性等，导致脂代谢的紊乱［7］。TNF-α还能激活细胞内信号转导通路NF-κB，诱导内皮细胞黏附分子如ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的表达，使单核细胞聚集、浸润，导致动脉粥样硬化病变的发展［13］。

Ridker等报道指出CRP是未来心血管病危险的最强有力的预示物［14］。CRP与动脉粥样硬化有关的可能机制［7］包括：①CRP诱导内皮细胞黏附分子的表达，从而启动和加速动脉粥样硬化的发展；②CRP通过调节动脉壁中的脂质而参与泡沫细胞的形成；③CRP可诱导单核细胞合成组织因子或通过激活补体，促进血栓形成。

本实验结果表明，荷丹片通过降低血脂水平，下调TNF-α、hs-CRP水平，上调脂联素水平，减弱炎症反应，抑制单核细胞聚集、减少内皮损伤和泡沫细胞生成，预防动脉硬化的发生、发展，这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。

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Effects of Hedan Tablets on serum lipid，inflammatory factor and morphological changes of APOE-/-M ice

ZHOU Yu-juan1， YU Bai-qing2， LIU Chun-ying1， LIU Zi-hao3
（1.Basic Medical College，Hebei Uniυersity，Baoding 071000，China；2.Graduate College，Hebei Uniυersity，Baoding 071000，China；3.Clinical College，Hebei Uniυersity，Baoding 071000，China）

AIM To investigate the effects of Hedan Tablets（Nelumbinis Folium，Salυiaemiltiorrhizae Radix et Rhizoma，Crataegi Fructus，Sennae Folium，Psoraleae Fructus）on serum lipid，adiponectin，TNF-α，hs-CRP and morphological changes of APOE-/-mice.METHODS Fifty APOE-/-mice were randomly divided into normal control group，themodel group，Hedan Tablets low and high dose groups and Simvastatin group.Mice in the control group were given ordinary chow and mice in other groups were given high cholesterol diet.After twelve weeks，mice were sacrificed to measure serum lipid.Adiponectin，TNF-α，hs-CRP were measured by ELISA. Morphological changes in aorta were observed under the lightmicroscope.RESULTS Compared with the control group，the serum lipid，TNF-α，hs-CRP significantly increased（P＜0.01），adiponectin significantly decreased（P＜0.01）and aortic morphology lesions were serious in themodel group.Compared with themodel group，the serum lipid，TNF-α，hs-CRP significantly decreased（P＜0.01），adiponectin significantly increased（P＜0.05）and aortic morphology lesions were reduced in Hedan Tablets groups and Simvastatin group.CONCLUSION Hedan Tablets can reduce the levels of serum lipid，TNF-α，hs-CRPwhile increase adiponectin level of APOE-/-mice，and then inhibit the formation of atherosclerosis.

Hedan Tablets；atherosclerosis；APOE-/-mouse；serum lipid；adiponectin；TNF-α；hs-CRP；morphological change

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0497-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.007

2014-05-26

河北大学医学学科专项基金建设项目（2012A3001）

周玉娟（1964—），女，硕士，教授，从事心血管药理学研究。Tel：（0312）5075538，E-mail：zyj@hbu.edu.cn