甜菜碱调控RhoA/ROCK信号通路抑制大鼠急性心肌缺血损伤

袁娅妮， 毛福英， 刘俊梅， 买淑霞， 王 洋， 戴贵东， 郑 萍，4*

（1.宁夏医科大学药学院药理学系，宁夏　银川　750004；2.银川市口腔医院，宁夏　银川　750004；3.凯里学院化学与材料工程学院制药工程教研室，贵州　凯里　556011；4.宁夏回药现代化工程技术研究中心，宁夏　银川　750004）

甜菜碱调控RhoA/ROCK信号通路抑制大鼠急性心肌缺血损伤

袁娅妮1， 毛福英1， 刘俊梅1， 买淑霞1， 王 洋2， 戴贵东3， 郑 萍1，4*

（1.宁夏医科大学药学院药理学系，宁夏银川750004；2.银川市口腔医院，宁夏银川750004；3.凯里学院化学与材料工程学院制药工程教研室，贵州凯里556011；4.宁夏回药现代化工程技术研究中心，宁夏银川750004）

目的 探讨从枸杞中分离得到的甜菜碱对异丙肾上腺素（ISO）诱导的大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用机制。方法 大鼠分别灌胃给予不同剂量甜菜碱（100、200和400 mg/kg）共40 d，于第39天和第40天皮下注射ISO 85 mg/（kg·d）诱发大鼠急性心肌缺血。取大鼠心肌组织进行病理学观察，ELISA法测定血清TGF-β1与ET-1的水平，并采用Western-blot法测定相关蛋白的表达。结果 与模型组比较，甜菜碱（100、200和400 mg/kg）明显改善心肌组织坏死，炎细胞浸润及间质水肿。甜菜碱（100、200、400 mg/kg）可明显降低血清TGF-β1及ET-1的水平（P＜0.01），抑制心肌组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达的升高（P＜0.01）。结论 甜菜碱可通过调控RhoA/ROCK信号通路保护ISO诱导的大鼠急性心肌缺血损伤。

甜菜碱；异丙肾上腺素；急性心肌缺血；TGF-β1；ET-1；RhoA/ROCK信号通路

甜菜碱（betaine）是从宁夏药食两用回药材中宁枸杞Lycium barbarum L.中分离得到的，化学名为三甲基甘氨酸，结构与氨基酸、胆碱类似，属于季胺碱类物质。甜菜碱具有保护肝脏、缓和应激、镇静、抗肿瘤等药理作用［1］。研究表明，甜菜碱具有抗氧化作用，可抑制异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）致大鼠急性心肌缺血［2］。急性心肌缺血可引发急性心绞痛和急性心肌梗死，严重威胁人类生命健康。心肌缺血的发病机制与RhoA/ ROCK信号通路密切相关，已成为近年来研究的热点［3］。有文献报道，ISO诱导的大鼠急性心肌缺血可激活RhoA/ROCK信号通路，增加RhoA和ROCK蛋白的表达［4-6］。本实验旨在以ISO诱导的大鼠急性心肌缺血为模型，重点考察甜菜碱对大鼠心肌组织RhoA/ROCK信号通路的影响，阐明甜菜碱对急性心肌缺血的作用机制。为其进一步的开发与应用提供科学依据。

1　材料

1.1实验动物 清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量100～120 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号SYXK（宁）2013-0001。

1.2药品与试剂 甜菜碱购自Aesar Johnson Mathey公司，纯度＞99.0%，（批号C8435A），用生理盐水溶解配制成1%、2%和4%的甜菜碱溶液待用；异丙肾上腺素购自上海梯西爱有限公司，纯度＞99.0%；0.9%氯化钠注射液购自广西裕源药业有限公司；TGF-β1及ET-1酶联免疫反应检测试剂购自武汉华美试剂有限公司；凯基全蛋白提取试剂盒、凯基BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；RhoA、ROCK1及ROCK2一抗购自Abcam公司，山羊抗小鼠，山羊抗兔二抗及小鼠抗β-actin抗体均购自北京中杉金桥生物技术公司；实验用水为超纯水。

1.3仪器 TY96-ⅡN型超生细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；H1850R型台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；Mutiskan Go酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；PowerPac Basic电泳仪（美国BIO-RAD公司）；培清JS-860B凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司）。

2　方法

2.1急性心肌缺血模型的建立 72只清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为6组：正常对照组、ISO组、ISO+甜菜碱（100、200和400 mg/kg）组、单用甜菜碱（400mg/kg）组，每组12只。甜菜碱分别按400、200、100 mg/kg灌胃给药，共40 d，正常对照组和ISO组灌胃给予等体积生理盐水。第39天和第40天ISO组和ISO+甜菜碱（100、200和400 mg/kg）组于灌胃1 h后皮下注射给予ISO 85 mg/（kg·d）建立大鼠急性心肌缺血模型，每日1次，连续2 d，正常对照组和单用甜菜碱组大鼠皮下注射相应体积生理盐水。末次给药24 h后，大鼠股动脉放血，收集血液并在室温下静置1 h，6 000×g离心10 min，-20℃冰箱中冻存；取部分心脏组织用4%多聚甲醛固定，其余部分经液氮冻存后置-80℃冰箱中保存备用。

2.2病理学组织观察 4%多聚甲醛固定的心肌组织用流水冲洗以去除留在组织内的固定液，然后梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（HE）染色处理，光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化。

2.3血清TGF-β1和ET-1的测定 取-20℃保存

3　结果

3.1心肌组织的形态学变化 光镜下结果显示，正常对照组和单用甜菜碱组大鼠横纹清晰，心肌细胞排列整齐，着色均匀。ISO组大鼠部分区域心肌细胞坏死，横纹不齐或消失，有炎性因子渗出，并伴有间质水肿。ISO+甜菜碱（100、200和400 mg/kg）依次减轻大鼠心肌缺血损伤程度，改善ISO引起的心肌组织形态学改变，见图1。

3.2血清TGF-β1与ET-1水平 与正常对照组比较，ISO组大鼠血清中TGF-β1与ET-1水平明显升高（P＜0.01）。与ISO组比较，ISO+甜菜碱（100、200和400 mg/kg）能显著抑制TGF-β1和ET-1的分泌（P＜0.01）。单用甜菜碱（400 mg/kg）对正常大鼠血清TGF-β1与ET-1水平没有影响，见表1。

3.3心肌组织RhoA、ROCK1和ROCK2的表达Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，ISO组RhoA、ROCK1和ROCK2的表达明显增加（P＜0.01）。ISO+甜菜碱（100、200和400 mg/kg）可显著抑制ISO致RhoA、ROCK1和 ROCK2蛋白表达的增加（P＜0.01）。单用甜菜碱（400 mg/kg）对正常心肌组织蛋白表达无影响，见图2～图4。的大鼠血清。分别按TGF-β1和ET-1酶联免疫试剂盒说明书进行操作。

2.4Western blot检测 取约50 mg心肌组织，经液氮研磨，加入0.4 mL冷裂解缓冲液，冰浴下超声破碎细胞。于4℃，6 953×g离心10min，取上清蛋白定量，剩余上清加入上样缓冲液于100℃水浴10 min，-20℃保存。取蛋白样本60μg上样，（7.5%或10%）SDS-PAGE凝胶电泳（80 V/120 V电压）进行分离，200 mA恒定电流将蛋白转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别用抗RhoA抗体（1∶2 000）、抗ROCK1抗体（1∶500）、抗ROCK2抗体（1∶1 000）及抗β-actin抗体（内参，1∶1 000），4℃孵育过夜。分别加入山羊抗兔（偶联有辣根过氧化物酶，1∶3 000）和山羊抗小鼠二抗（偶联有辣根过氧化物酶，1∶5 000）常温孵育2 h，加入超级化学发光底物反应液，曝光胶片。胶片扫描结果采用Quantity-one软件分析，将目的条带的光密度值与其相对应的内参β-actin的光密度值相比以校正误差，所得比值代表该目的蛋白的相对含有量。

图1　甜菜碱对ISO诱导的急性心肌缺血损伤大鼠病理组织变化的影响（HE，200×）Fig.1 Effects of betaine on cardiac histopathological changes of ISO-induced acute myocardial ischem ic injury in rats（HE 200×）

表1　甜菜碱对ISO诱导心肌缺血损伤大鼠血清内皮素和生长转化因子的影响（±s，n=8）Tab.1 Effects of betaine on serum levels of endothelin-1（ET-1）and transform ing grow th factor-β1（TGF-β1）in ISO-induced m yocardial injury rats（±s，n=8）

表1　甜菜碱对ISO诱导心肌缺血损伤大鼠血清内皮素和生长转化因子的影响（±s，n=8）Tab.1 Effects of betaine on serum levels of endothelin-1（ET-1）and transform ing grow th factor-β1（TGF-β1）in ISO-induced m yocardial injury rats（±s，n=8）

注：与正常对照组相比，**P＜0.01；与ISO组相比，##P＜0.01

组别ET-1/（pg·mL-1）TGF-β1/（pg·mL-1）正常对照组25.03±2.49 30.56±1.44甜菜碱400 mg/kg组23.88±1.97 32.53±3.55 ISO 85 mg/kg组63.72±3.02**73.08±4.60**甜菜碱100 mg/kg+ISO组42.68±4.08##53.62±3.84##甜菜碱200 mg/kg+ISO组36.28±2.81##46.36±3.38##甜菜碱400 mg/kg+ISO组25.08±3.02##32.15±3.10##

4　讨论

甜菜碱是一种季胺类生物碱，可以作为甲基供体降低血浆同型半胱氨酸的水平而抑制心血管疾病发生，甜菜碱具有治疗高同型半胱氨酸血症，抗动脉粥样硬化，保护心肌缺血损伤的作用［2，7］。早在1999年，Mar等人研究表明，法国商业用酒中加入一定量的甜菜碱，有利于脂肪降解，并能够抑制缺血性心脏病的发作［8］。心肌缺血（myocardial ischemia）的本质是由于心脏供氧与需氧的不平衡所造成的。ISO能激动心脏β1受体，使心肌兴奋性提高，收缩和心率加快，代谢增强，增加心肌耗氧量，此外，它也能激动β2受体，使外周血管扩张，回心血量减少，动脉压下降，冠脉血流量减少［9］。本实验采用皮下注射ISO（85 mg/kg）建立大鼠急性心肌缺血模型，病理结果显示，ISO组大鼠心肌细胞坏死甚至融合成片状，伴有间质水肿和炎细胞浸润，与文献报道结果一致［10］，甜菜碱（100、200和400 mg/kg）能明显改善ISO诱导的急性心肌缺血大鼠心肌组织形态学改变，减轻心肌病理损伤。提示，甜菜碱对大鼠急性心肌缺血具有保护作用。

图2　甜菜碱对ISO诱导的急性心肌缺血大鼠心肌组织RhoA表达的影响（±s，n=8）Fig.2 Effects of betaine on expression of RhoA in hearts from ISO-induced myocardial ischem ic rats（±s，n=8）

RhoA是一种小分子GTP结合蛋白，RhoA的下游效应蛋白ROCK，又称Rho激酶，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调节许多基础的细胞功能如迁移、收缩、黏附等，ROCK有两个亚型，ROCK1（ROCKβ）和ROCK2（ROCKα），二者在体内广泛表达，前者主要在肝、肺、脾、肾中表达，后者主要在大脑和骨骼肌中表达，两者均在心脏和血管平滑肌表达［11］。其过度表达与高血压、心肌肥厚、心衰等心血管病的发生密切相关［12］。有文献报道，在ISO诱导的大鼠急性心肌缺血中，RhoA/ROCK信号通路蛋白表达增加，黄连碱预防给药可以降低RhoA及ROCK蛋白的表达，保护缺血的心肌组织［6］。临床和实验研究表明，ROCK抑制剂Y-27632和法舒地尔抑制RhoA/ROCK信号途径后，可减轻心肌缺血［3，13］。本实验结果显示，ISO可诱导大鼠心肌组织RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表达增加，预先给予甜菜碱（100、200和400 mg/kg）后，心肌组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达均显著降低。提示，甜菜碱对ISO诱导的急性心肌缺血损伤保护作用的机制与抑制RhoA/ ROCK信号通路有关。

图4　甜菜碱对ISO诱导的急性心肌缺血大鼠心肌组织ROCK 2表达的影响（±s，n=7）Fig.4 Effects of betaine on the expression of ROCK2 in hearts from ISO-induced myocardial ischem ic rats（±s，n=7）

此外，研究表明，心肌缺血时，损伤的心肌细胞会释放细胞因子如TGF-β、ET-1等，RhoA/ ROCK信号通路可被TGF-β、ET-1等细胞因子激活［14-16］。本实验结果显示，ISO可诱导大鼠血清TGF-β1和ET-1水平升高，甜菜碱（100、200和400 mg/kg）预防给药后，血清TGF-β1和ET-1水平明显下降。

综上所述，甜菜碱对ISO诱导的大鼠急性心肌缺血损伤具有保护作用，其机制可能与抑制TGF-β1和ET-1释放，调控RhoA/ROCK信号通路有关。

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Betaine protects against isoproterenol-induced acutem yocardial ischem ic injury through the regulation of RhoA/ROCK pathway

YUAN Ya-ni1， MAO Fu-ying1， LIU Jun-mei1， MAIShu-xia1， WANG Yang2， DAIGui-dong3，ZHENG Ping1，4*
（1.School of Pharmacy，Ningxia Medical Uniυersity，Yinchuan 750004，China；2.Yinchuan Stamotology Hospital，Yinchuan 750004，China；3.Department of Pharmaceutical Engineering，School of Chemical and Materials Engineering，KailiUniυersity，Kaili556011，China；4.Ningxia Engineering &Technology Research Center for Modernization of HuiMedicine，Yinchuan 750004，China）

AIM To investigate the cardioprotective effects of betaine extracted from Lycium barbarum L.onregulation of RhoA/ROCK pathway in isoproterenol-induced acute myocardial ischemia.METHODS Betaine（100，200 and 400 mg/kg）was administered orally once a day for forty days，and acutemyocardial injury was induced by subcutaneous injection of isoproterenol（85 mg/kg）in rats on the 39th and 40th day.Myocardial injury was examined by histopathological evaluation.Serum levels of transforming growth factor（TGF）-β1 and endothelin（ET）-1 were analyzed by ELISA.In addition，the protein expression of RhoA、ROCK1and ROCK2 were measured byWestern-blot.RESULTS Oral administration of betaine（100，200 and 400 mg/kg）attenuatedmyocardial necrosis，interstitial edema，and inflammatory cell infiltration.Moreover，the treatment with betaine decreased isoproterenol-induced elevated serum levels of TGF-β1 and ET-1（P＜0.01）aswell as increased protein expression of RhoA，ROCK1 and ROCK2（P＜0.01）.CONCLUSION The present study has demonstrated that betaine protects against isoproterenol-induced myocardial ischemia via down-regulating RhoA/ROCK pathway.

betaine；isoproterenol；acute myocardial ischemic injury；TGF-β1；ET-1；RhoA/ROCK pathway

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0492-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.006

2014-05-04

国家自然科学基金资助项目（81160403）

袁娅妮（1990—），女，硕士生，研究方向为心血管药理。E-mail：yuanyani222@163.com

郑 萍（1973—），女，硕士，副教授，研究方向为心血管药理。Tel：（0951）6980123，E-mail：zhengping2004@ 126.com

网络出版日期：2014-09-23

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140923.1211.001.html