复方血脂宁环糊精提取物对大鼠高脂血症和肝脏脂肪变性的影响

杨建文， 刘亚男， 高 杰， 陈丽娜， 任晓亮， 戚爱棣

（天津中医药大学中药学院，天津　300193）

复方血脂宁环糊精提取物对大鼠高脂血症和肝脏脂肪变性的影响

杨建文， 刘亚男， 高 杰， 陈丽娜， 任晓亮*， 戚爱棣

（天津中医药大学中药学院，天津300193）

目的 观察复方血脂宁的β-环糊精提取物对大鼠高脂血症和肝脏脂肪变性的防治作用。方法 建立SD大鼠高脂血症模型，采用分组灌胃给药，8周后分别观察复方血脂宁环糊精提取物与传统水提物对其血脂和肝脏脂肪变性防治作用。结果 血脂宁的环糊精提取物组和传统水提物组均能降低大鼠血清谷丙转氨酶、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和肝组织丙二醛水平，升高血清高密度脂蛋白胆固醇和肝组织超氧化物歧化酶水平，具有改善高脂血症大鼠血脂指标和肝脏脂肪变性的作用，且环糊精提取物组具有相对更加明显的改善作用。结论 血脂宁的不同提取物对大鼠高脂饮食诱导的高脂血症和肝脏脂肪变性有防治作用，且β-环糊精提取物效果优于传统提取物。

高脂血症；肝脏脂肪变性；血脂宁；环糊精提取物

高脂血症（hyperlipidemia，HLP）又称脂质代谢紊乱或异常，是指由于脂质代谢或运转异常而导致血浆中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及甘油三脂中一种或多种脂质水平超过正常范围高限的病症。高脂血症可以诱导产生肝脂肪变性，重度肝脂肪变性称为脂肪肝，可引起肝肿大、痛压和肝功能异常。中药制剂血脂宁丸收载于《中国药典》2010年版一部中，由制首乌、决明子、荷叶、山楂等四味药组成，具有化浊降脂、润肠通便的功效，适用于痰浊阻滞型高脂血症。现代药理学研究表明，血脂宁丸中降脂保肝的主要成分为：何首乌中的二苯乙烯苷和大黄素；决明子中的总蒽醌类成分；荷叶中的荷叶碱以及黄酮类成分槲皮素；山楂中的山楂黄酮。然而这些成分均存在不同程度水溶性差以及不稳定等缺点，使其提取以及利用受限。环糊精（cyclodextrin，简称CD）是一种由淀粉经过酶解后形成的具有环状结构的淀粉衍生物，具有简单易得、廉价、应用广泛、生物毒性低、水溶性好等特点，可与多种药物分子包合形成复合物，增加药物的溶解性［1］、稳定性［2］，提高提取效率［3-8］。本实验以血脂宁丸为基础研究复方血脂宁的环糊精提取物对高脂饮食诱导的大鼠高脂血症和肝脂肪变性的影响，为今后临床应用血脂宁治疗高脂血症以及环糊精在中药领域的应用提供实验依据，为中药复方提取及制剂工艺的研究开发提供新的方法和思路。

1　材料

1.1实验动物 雄性健康SD大鼠，体质量（200±20）g，SPF级，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2009-0004。

1.2仪器 7020全自动生化分析仪（日本株式会社日文高新技术）；EnSpire酶标仪（上海珀金埃尔默仪器有限公司PerkinElmer）；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；光学显微镜（奥林巴斯，BX41）；2-16A高速台式离心机（东菀市塘厦鑫磊仪器厂）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；JMF-320多级闪蒸器（金鼎科技仪器有限公司）。

1.3主要试剂与试药 β-环糊精（孟州市华兴生物化工有限责任公司）；0.9%生理盐水；冰醋酸，分析纯；10%中性甲醛溶液；石蜡；苏木素-伊红染色剂（hematoxylin and eosin，HE）；水为超纯水。

血清总胆固醇（TC）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒均由北京中生北控生物科技股份有限公司研究生产，批号121431；丙二醛（MDA）试剂盒，总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量试剂盒购自天津原平皓生物技术有限公司。

1.4高脂饲料 72.8%普通饲料+10%猪油+10%糖+ 2%胆固醇+5%蛋黄+0.2%胆碱。

1.5复方血脂宁的制备 药材决明子（产地：河北）、制首乌（产地：四川）、荷叶（产地：河北）、山楂（产地：河北）购于安国市长安中药材有限公司，经天津中医药大学李天祥教授鉴定分别为决明Cassia obtusifolia的种子、何首乌Polygonum multif lorum Thunb的块根、莲Nelumbo nucifera Gaertn的叶、山楂Crataegus pinnatifida Bge.的果实。标本存于天津中医药大学中药学院。

血脂宁的传统水提物制备方法：称取生药决明子72 g、制何首乌48 g、荷叶36 g、山楂24 g，加蒸馏水4 500 mL，冷浸1 h后，加热煮沸后回流2 h，倾出滤液，同法回流提取3次，合并滤液后用旋转蒸发仪浓缩至270 mL，放入冰箱备用。

血脂宁的环糊精提取物制备方法：称取生药决明子72 g、制何首乌48 g、荷叶36 g、山楂24 g，加含有9 gβ-环糊精的蒸馏水4 500 mL，冷浸1 h后，加热煮沸后回流2 h，倾出滤液，同法回流提取3次，合并滤液后用旋转蒸发仪浓缩至270 mL，放入冰箱备用。

2　方法

2.1动物饲养与造模 SD大鼠先用基础饲料适应性喂养1周，环境温度20～24℃，光照时间8∶00～18∶00。然后随机取其中8只大鼠作为正常对照组大鼠，以普通饲料饲养，其余大鼠以高脂饲料不限量饲养（高脂饲料组）。8周后将所有大鼠眼眶取血，3 000 r/min离心10 min后取上清液制备血清，结合测定试剂盒使用全自动生化分析仪测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST水平，从正常对照组与高脂饲料组中分别随机处死3只大鼠确定模型成立。

2.2动物给药 造模成功后遂以随机数字表法将其余高脂饲料组大鼠分为模型对照组、传统水提物组、环糊精提取物组，分别以生理盐水、血脂宁的传统水提物、血脂宁的环糊精提取物灌胃，其中后两组给药量按临床给药剂量换算得到并由同样量的处方提取所得，为6.75 g/（kg·d）。正常对照组以生理盐水灌胃，持续灌胃8周。

2.3实验指标测定

2.3.1一般情况 实验期间每周称体质量1次，观察食欲行为、粪便、毛发及动物死亡情况。

2.3.2血清生化指标的测定 灌胃给药8周后，各组小鼠禁食不禁水12 h，眼眶取血，分离血清。血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST量的测定在全自动生化分析仪上进行。

2.3.3体质量、肝湿重测定 灌胃给药8周后，处死各组大鼠，称量体质量，迅速摘取整个肝脏，用0.9%生理盐水冲洗，用滤纸吸干表面水分后称量肝湿质量，计算肝脏指数（liver index，LI，LI=肝湿质量/体质量×100%）。

2.3.4肝组织匀浆的制备及肝匀浆指标的测定 称取大鼠肝组织200 mg，加冰的生理盐水1.8 mL（1∶9，m/V）后用组织匀浆器于4℃匀浆8 min，2 000 r/min离心15 min后取上清液，得到10%肝组织匀浆，按试剂盒方法分别测定肝组织匀浆中的MDA水平以及SOD活性。肝组织匀浆中蛋白浓度根据BCA蛋白测定试剂盒说明书测定。

2.3.5肝脏病理学改变 灌胃给药8周后取肝脏作肉眼观察，并作病理学检查，观察各组大鼠肝脏发生脂肪变性的情况。肝组织经10%中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片，进行HE染色，光镜下评估。

评估的标准 病理科医生对切片染色结果按LEE［9］的标准进行盲法评分。根据肝细胞含脂肪量将脂肪变性评分为0～4分（无，0分；≤25%，1分；25%～50%，2分；50%～75%，3分；≥75%，4分）；每低倍视野下坏死灶数评价炎症程度（无，0分；l个病灶，1分；2个以上病灶，2分；桥接或融合性坏死，3分）；纤维化程度（无，0分；灶性或不完全性非桥接纤维化，≤50%肝小叶，1分；广泛非桥接纤维化，＞50%肝小叶，2分；桥接纤化，3分；肝硬化，4分）。

3　统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学处理。所有数据均用（±s）来表示。计量资料各组数据间比较用单因数方差分析，然后用LSD法进行两两比较；两均数比较采用独立样本t检验。计数资料采用Kruskal-Wallis和Mann-Whitney法多样本比较秩和检验。P＜0.05有统计学意义。

表1　血脂宁提取物对高脂血症大鼠血脂的影响（±s）

表1　血脂宁提取物对高脂血症大鼠血脂的影响（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与传统水提取物组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别动物数TC/（mmol·L-1）TG/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）HDL-C/（mmol·L-1）ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）正常对照组5 1.37±0.17 0.60±0.18 0.24±0.12 1.15±0.19 33.20±5.54 147.2±16.21模型对照组5 2.01±0.10##0.98±0.08##0.57±0.16##0.85±0.04##53.00±5.43##149.4±7.77传统水提物组5 1.82±0.16*0.84±0.04*0.37±0.04*1.00±0.05*45.00±4.58*130.6±14.62环糊精提取物组5 1.63±0.09**0.70±0.02**0.58±0.08 1.01±0.03*38.80±0.84**154.20±16.65△

4　结果

4.1一般情况 给药后期个别大鼠有轻微腹泻现象，其余大鼠生长发育良好，无意外死亡。与正常对照组相比较，模型对照组大鼠活动少，食欲下降，体质量增加，尿色黄，大便较软，部分大鼠有腹泻现象；血脂宁提取物组大鼠状态好于模型对照组。

4.2复方血脂宁环糊精提取物对高脂血症大鼠血脂的影响

如表1所示，造模后测得模型对照组大鼠血清指标中除AST值外，其他指标值均与正常对照组有显著性差异，其中TC、TG、LDL-C、ALT值高于正常对照组，HDL-C值低于正常对照组；除AST外，传统水提物组大鼠血清的其他指标值均与模型对照组有差异（P＜0.05），其中TC、TG、LDL-C、ALT值低于模型对照组，HDL-C值高于模型对照组，而AST值低于模型对照组，但无统计学差异（P＞0.05）；环糊精提取物组大鼠的血清中TC、TG值显著低于模型对照组，HDL-C值高于模型对照组，ALT值低于模型对照组，TC、TG、LDL-C、ALT、AST值与传统提取物组有差异（P＜0.05）。由此表明血脂宁的环糊精提取物较传统水提物对高脂血症大鼠的降脂作用有更好的效果。

4.3复方血脂宁环糊精提取物对高脂血症大鼠肝脏指数的影响 模型组大鼠肝指数显著高于正常组，传统水提物组、环糊精组与模型组相比，大鼠肝指数较后者有显著性差异（P＜0.05）（见表2）。

表2　血脂宁提取物对高脂血症大鼠肝脏指数的影响（±s）

表2　血脂宁提取物对高脂血症大鼠肝脏指数的影响（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与传统水提取物组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别动物数体质量/g肝脏湿质量/g肝指数/%正常对照组5 575.4±45.18 13.16±1.36 2.28±0.12模型对照组5 601.0±43.71 18.52±1.69##3.08±0.09##传统水提物组5 598.4±47.70 16.91±2.24 2.82±0.21*环糊精提取物组5 560.4±65.16 14.40±1.83**△2.57±0.23**△

4.4复方血脂宁环糊精提取物对高脂血症大鼠肝脏脂肪变性的影响 正常对照组大鼠肝脏灰褐色，切面灰红；模型对照组大鼠肝脏灰白，灰黄区域呈网状分布，切面灰黄、红黄相间；传统水提物组大鼠肝脏灰黄、灰白，灰黄区域呈网状分布，切面灰黄、灰褐；环糊精提取物组大鼠肝脏灰黄、灰褐，切面红黄相间、实性、质中（见图1）。

图1　血脂宁提取物对大鼠肝脏的影响

4.5复方血脂宁环糊精提取物对高脂血症大鼠肝组织形态的影响正常对照组大鼠肝脏基本结构存在，小叶结构清晰，无明显界板炎，肝细胞索排列规则，未见明显纤维化及炎细胞浸润；模型对照组大鼠肝脏2、3区肝细胞重度脂肪变性，以小、中泡混合型为主，汇管区可见轻度纤维化；传统水提物组大鼠肝脏基本结构存在，小叶结构完整，肝细胞2、3区中度脂肪变性，小泡型为主，伴轻度纤维化；环糊精提取物组大鼠肝脏基本结构存在，小叶结构完整，肝细胞2、3区轻度脂肪变性，以小泡型为主，未见明显纤维化（见图2）。由此可见模型对照组肝脂肪变性较为严重，传统水提物组大鼠肝脂肪变性较模型对照组稍有减轻，环糊精提取物组大鼠肝脂肪变性较模型对照组、传统水提物组大鼠有所减轻。

图2　血脂宁提取物对高血脂症大鼠肝脏脂肪变性的影响

肝组织病理学评分结果如下，模型组大鼠三项指标评分均高于正常组，传统水提物组和环糊精提取物组大鼠三项指标较模型组均降低，其中脂肪变性评分有统计学差异（P＜0.05），而炎症坏死与纤维化评分有降低趋势，但均无统计学差异（见表3）。

表3　环糊精提取物对高脂血症大鼠肝脏组织学的影响（±s）

表3　环糊精提取物对高脂血症大鼠肝脏组织学的影响（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别n组织学变化程度脂肪变性炎症坏死纤维化正常对照组5 1.8±0.45 1.0±0.71 0.2±0.45 5 1.0±0.00 0.8±0.45 0.0±0.00模型对照组5 2.2±0.45##1.4±0.55 0.6±0.55#传统水提物组5 2.0±0.00**1.2±0.48 0.4±0.55环糊精提取物组

4.6复方血脂宁环糊精提取物对高脂血症大鼠肝脏SOD活性、组织MDA水平变化的影响 模型对照组大鼠肝组织的MDA值显著高于正常组，SOD值显著低于正常组（P＜0.05）；传统水提物组以及环糊精提取物组大鼠肝组织的MDA值显著低于模型组，SOD值高于模型对照组（P＜0.05）；环糊精提取物组大鼠肝组织较传统水提物组MDA值有降低趋势，但无统计学差异（P＞0.05）（见表4）。

表4　血脂宁提取物对高脂血症大鼠肝脏组织MDA水平、SOD活性的影响（±s）

表4　血脂宁提取物对高脂血症大鼠肝脏组织MDA水平、SOD活性的影响（±s）

注：与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别动物数MDA/（nmol·mgprot-1）SOD/（U·mgprot-1）正常对照组5 1.11±0.14 173.37±24.40模型对照组5 2.26±0.51##134.56±16.65##传统水提物组5 1.21±0.08**168.69±15.30**环糊精提取物组5 1.11±0.04**163.06±11.17*

5　讨论

长期摄入高脂食物，脂肪吸收增加，TG和胆固醇合成超过其运转，在肝细胞内蓄积，形成高脂血症和肝脂肪变性。本实验以单纯高脂饮食诱导大鼠高脂血症模型，从该实验结果来看用此方法造模8周后模型大鼠血清TG、TC等值高于正常组，HE染色结构显示模型大鼠肝脏出现明显的脂肪变性，但血清AST值与正常组大鼠相比无统计学差异，提示该模型尚处于单纯性肝脂肪病变阶段。

通过单因素考察与正交试验，以复方血脂宁主要活性成分的提取率为评价指标，确定血脂宁环糊精提取物的最佳提取工艺为：称取决明子72 g、制何首乌48 g、荷叶36 g、山楂24 g，加蒸馏水4 500 mL，冷浸1 h后，加热煮沸后回流2 h，倾出滤液，同法回流提取3次后合并滤液。

经本实验证实，与传统水提取物组相比，血脂宁的环糊精提取物组大鼠肝指数、血清中TG、TC、HDL-C、ALT指标以及肝组织中MDA、SOD均有所改善，血脂宁的环糊精提取物较传统水提取物对高脂血症以及肝脂肪变性有更显著的防治作用，分析其原因可能是：β-环糊精对血脂宁中主要降脂成分萘骈吡喃酮糖苷类、二苯乙烯苷类、蒽醌类、生物碱类以及黄酮类等成分具有良好包和作用，通过增加难溶性成分如大黄素等蒽醌类、荷叶碱等生物碱类以及槲皮素［10］等黄酮类化合物的溶解度，提高不稳定性成分如槲皮素、大黄素、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷、二苯乙烯苷［11-13］、荷叶碱等化合物的稳定性两方面提高化合物的提取转移率；给药后环糊精的包合作用还可以促进有效成分的吸收［14］，提高血脂宁中活性成分的生物利用度，最终表现为提高了血脂宁治疗高脂血症的疗效。

经本实验证实，血脂宁的环糊精提取物较传统提取物对肝脂肪变性有更显著的防治作用，为今后临床合理应用复方血脂宁治疗高脂血症、改善肝脂肪变性的应用提供理论及实验依据［15］，为其他中药及复方的β-CD包合提取提供参考，为环糊精在中药领域的进一步研究与研发提供基础。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0649-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.043

2014-01-19

国家自然科学基金面上项目（81473543）

杨建文（1987—），男，硕士生，研究方向为药物分析。Tel：15620601460，E-mail：tom jiwen@126.com

任晓亮，男，讲师，研究方向为中药学及药物分析。Tel：（022）59596221，E-mail：xiaoliang_ren@sina.com