超临界二氧化碳萃取齿瓣石斛

包晓青， 梁明在， 吴志刚， 陶正明*， 林智雄

（1.温州医科大学，浙江　温州　325035；2.浙江省亚热带作物研究所，浙江　温州　325005；3.台湾义守大学化学工程系，台湾　高雄　84001）

超临界二氧化碳萃取齿瓣石斛

包晓青1，2， 梁明在3， 吴志刚2， 陶正明2*， 林智雄3

（1.温州医科大学，浙江温州325035；2.浙江省亚热带作物研究所，浙江温州325005；3.台湾义守大学化学工程系，台湾高雄84001）

目的 采用超临界二氧化碳萃取（SFE）法萃取齿瓣石斛。方法 使用正己烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙醇作为夹带剂。SFE萃取分两阶段和一阶段萃取，前者使用纯CO2萃取，再添加夹带剂萃取；后者直接泵入夹带剂与CO2共同萃取，以比较两法的萃取效率。结果 乙酸乙酯作为夹带剂更有利于齿瓣石斛中低极性化合物的溶出。直接泵入乙酸乙酯与CO2共萃的方式更有利于齿瓣石斛中各成分的溶出。结论 本实验萃取方式为未来齿瓣石斛的进一步研究提供良好的基础。

齿瓣石斛；超临界二氧化碳萃取；夹带剂；乙酸乙酯

石斛为我国传统医学中常用的贵重药材，药用历史悠久，在众多石斛属中，齿瓣石斛Dendrobium deυonianum Paxt.是近年来被研究发现的一种新的中药石斛，其野生及栽培量较大，而且经化学成分、药理等方面的研究结果表明其质量与目前市场上应用最为广泛的铁皮石斛类似程度极大［1-2］，有研究者［3］从齿瓣石斛中分离得到具有抗氧化活性的化合物，具有较好的清除自由基能力，清除率达到84%。另有学者［4］利用GC-MS鉴定出齿瓣石斛中48种脂溶性成分，并具有重要的药理活性。在目前的研究中，多以有机溶剂回流提取齿瓣石斛，但这些方法具有溶剂消耗量大、费时、溶出成分低等缺点。超临界流体萃取技术（SFE）作为一种新型的提取分离技术，在药用植物有效成分的提取分离中得到广泛应用［5-7］。特别是超临界二氧化碳具有气体扩散性及液体溶解能力［8］、临界点低（7.2 MPa、32℃）易操作，以及流体减压后即可气化与萃取物分离等优点，并能有效降低萃取的温度与有机溶剂用量，达到活性保留且降低能源消耗的目的［9］。例如，林杰等［10］利用超临界二氧化碳从柚子粉中提取柚皮苷，发现用该方法萃取柚皮苷具有萃取速度快，提取率高，产品的纯度好等优点。张郁松［11］采用超临界CO2流体萃取法从干红辣椒中得到的辣椒红色素，与传统方法相比，辣椒红色素要更稳定、没有辣味、色泽鲜艳、感官品质明显优于有机法。并且超临界流体萃取技术能选择性地按照成分极性大小、沸点高低和分子质量大小依次萃取出来，比较适用于提取中低极性成分［12］。本研究利用超临界流体萃取技术对齿瓣石斛进行萃取，探讨该萃取方式对齿瓣石斛中各成分溶出程度的影响。

1　材料

1.1仪器 超临界萃取设备（台湾金属工业研究发展中心）；高效液相色谱仪（泵HITACHI L-2130），检测器（HITACHIL-4200 UV-Vis）；SAMPO KB-RD85U型真空烘箱；PANCHUM R-2000V1旋转蒸发仪。

1.2试剂 95%乙醇（景明化工股份有限公司，分析纯）；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、异丙醇等有机溶剂（友和贸易股份有限公司，色谱纯）；实验用水均为去离子水；CO2（锦德气体有限公司，纯度＞99.9%）。齿瓣石斛药材由浙江铁枫铁皮生物科技有限公司提供。

2　方法

2.1分析方法的建立 为了检测不同提取方法萃取齿瓣石斛的结果，本实验确定以HPLC作为定量的分析方法。Kromasil 100-5C18色谱柱（250 mm× 4.60 mm ID，5μm，Kromasil公司）；流动相为乙腈（A）-水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，30%A；5～15 min，30%→50%A；15～35 min，50%→70%A；35～50 min，70%→50%A；50～55 min，50%→30%A）。体积流量1.0 mL/min；检测波长210 nm；柱温25℃；进样量20μL。

2.2夹带剂的选择 由于纯二氧化碳对石斛中复杂成分的溶解度较低，所以在萃取过程中必须辅以适当比例的夹带剂以提高二氧化碳溶解度，而不同溶剂作为夹带剂，其萃取出的成分会有较大差异，因此首先使用不同有机溶剂分别提取药材，以选择合适的夹带剂。

称取定量齿瓣石斛干燥品，按质量比1∶30比例加入各萃取溶剂，使用的溶剂分别为正己烷（Hexanes）、异丙醇（L-propanol）、乙酸乙酯（EA），无水乙醇（EtOH），然后在50℃超声提取1.5 h，冷却，过滤，取残渣按照同样的方法再提取两次，合并3次续滤液，用旋转蒸发仪挥干溶剂，用甲醇复溶并转移至量瓶，定容，用0.45μm微孔滤膜滤过后进行HPLC分析。

2.3超临界萃取法 将干燥的齿瓣石斛药材用粉碎机粉碎，称定质量180 g装入萃取釜内。萃取时温度设定为50℃，萃取槽压力设定为35 MPa，二氧化碳体积流量设定为60 g/min。本实验的超临界萃取分2批次进行，第1批次为两阶段萃取法，首先单独使用纯二氧化碳进行萃取3 h后，再以混合质量分数8.970%乙酸乙酯的超临界二氧化碳萃取3 h，萃取过程当中，每30 min于分离槽中收集溶于乙酸乙酯的粗萃物，分别给予编号为SH001至SH012；第2批次实验为一阶段萃取法，即自萃取开始同时泵入质量分数8.970%乙酸乙酯与二氧化碳共持续萃取6 h，分别给予编号SH013至SH024。待样品（SH001～SH024）中二氧化碳挥发后称量每瓶的质量。前述实验每阶段收集的样品取6 mL置于离心管中进行真空干燥（40℃），计算粗萃物的质量变化，计算方法如公式1所示，藉此数据以了解1 kg齿瓣石斛中可获粗萃物的量，样品另以HPLC进行分析，以了解其组成变化［13-14］。

根据结果绘制成q对E的萃取曲线，其中q指所流过萃取斧的二氧化碳的质量与载入齿瓣石斛干质量的质量比，E代表粗萃出物与齿瓣石斛干质量的质量比，即齿瓣石斛的超临界流体萃取产物之萃取产率。

3　结果与分析

3.1不同有机溶剂萃取结果 从图1可以看出，极性最小的正己烷（Hexanes）提取的样品中成分种类较少，基本上未能萃取出石斛中的成分，异丙醇（L-propanol）、乙酸乙酯（EA）、无水乙醇（EtOH）溶剂能够更多的提取出石斛样品中的成分。而无水乙醇主要是萃取出其中极性大的物质，异丙醇和乙酸乙酯虽然也能将极性大的物质萃取出，但是其萃取量相对无水乙醇少些。在中小极性成分中，乙酸乙酯的提取效率相对其他溶剂提取率更高并且不会提取出太多的大极性成分，因此采用超临界二氧化碳萃取齿瓣石斛时可添加适量乙酸乙酯作为夹带剂进行萃取，以期加大中小极性成分的溶出。

图1　不同有机溶剂提取齿瓣石斛结果Fig.1 Extraction of Dendrobium devonianum by different solvents

3.2SFE萃取齿瓣石斛 将SFE萃取得到的齿瓣石斛粗萃物进行混合，直接从原液中吸取适量按“2.1”项中的分析方法进行HPLC分析（图2），由于在210 nm处乙酸乙酯会有吸收，故在图谱中会有较大的溶剂峰出现。从图2中可发现，SFE粗萃物中成分多样，并且大多数都属于中低极性化合物。

图2　SFE萃取齿瓣石斛之色谱图Fig.2 Analytical spectrum of Dendrobium devonianum Paxt.by SFE

本实验将图谱中较明显处的峰进行归类，按照极性从大到小依次分为5大组群，如图中1～5所标示。

3.2.1不同萃取批次总粗萃物的产率 图3为本研究中两次批次不同萃取方法得到的萃取曲线，其中空心方块标记代表单纯使用超临界CO2萃取石斛3 h，之后再泵入乙酸乙酯萃取3 h的实验，实心圆圈标记代表自萃取一开始便加入乙酸乙酯作为辅溶剂的萃取。

图3　不同萃取批次萃取产物的产率Fig.3 Total crude extract yields of different batches of extractions

两批次萃取实验进行萃取6 h后累积萃取率仍具有上升趋势，说明其中的粗萃物还未萃取完全，需要继续延长萃取时间。两阶段萃取法在萃取齿瓣石斛6 h后得到粗萃物约为500 g/kg，一阶段萃取方式能够得到粗萃物约为300 g/kg。

3.2.2不同萃取批次不同成分的产率 由于“3.2”项中定义的5大组群的各信号峰未能有含量标准曲线，故无法准确计算粗萃物中各成分的量，因此本实验假设用各信号峰的峰面积分别除以粗萃物的质量，代表各组成在粗萃物中的含有量，如果将其累加并对时间作图，则结果如图4所示，图中组群1～5分别表示图2中信号峰1～信号峰5，同样空心方块标记代表两阶段萃取，实心圆圈标记代表自萃取一开始便加入乙酸乙酯作为辅溶剂的萃取。

图4　运用SFE萃取齿瓣石斛得率Fig.4 Extract yields of Dendrobium devonianum Paxt.by SFE

从图4中可知，SFE从石斛中萃取出的主要5种成分大致随时间而减少，代表各成分含量随时间增加而愈来愈少。其中组群1，2两种成分的趋势类似，其余3种组群则大致相似。因此可以将5个信号峰大致分成两个族群。

族群一（即图2中信号峰1，2）在单独使用二氧化碳进行萃取时，该成分处于平稳增长状态，泵入乙酸乙酯共同萃取后，其在粗萃物中的含量明显增加，可能是该成分需在乙酸乙酯的辅助下，才能够大幅度萃取出。该族群若在实验开始就使用二氧化碳和乙酸乙酯共萃，其在粗萃物中的量迅速下降，之后处于平稳趋势，可能是由于该成分在开始时大部份成分就已经被萃取出。另外从图中可知使用两阶段萃取方式得到的粗萃物总量稍高于一阶段萃取。

族群二（即图2中信号峰3，4，5）在单独使用二氧化碳进行萃取时，该成分同样处于平稳增长状态，继而加入乙酸乙酯共萃其含有量有所增加，但增加幅度并不显著。若在实验开始就使用二氧化碳和乙酸乙酯共萃，其含有量在2 h内急剧增长后即不再增加，说明基本已经完全被萃取出来了。同时可知使用一阶段萃取方式得到的粗萃物总量远高于两阶段萃取。

4　小结与讨论

本实验采用超临界二氧化碳添加辅助溶剂乙酸乙酯共萃取的方式提取齿瓣石斛。在温度为50℃，萃取槽压力为35 MPa，二氧化碳体积流量为60 g/min时进行两批次不同方式的萃取，发现先用纯二氧化碳进行萃取继而泵入乙酸乙酯共萃的方式更有利于总粗萃物的溶出。

族群一化合物为相对极性较大的化合物，在单独使用纯二氧化碳萃取时，由于二氧化碳对极性化合物的溶解能力不足，因此族群一化合物未能较多地被萃取出，当泵入乙酸乙酯共萃后，其溶出程度大幅度增加，说明族群一化合物需要在在乙酸乙酯的辅助下，才能够被大量萃取出。虽然先使用纯二氧化碳萃取后在泵入乙酸乙酯与二氧化碳共萃的方式得到的萃取物总量比直接使用两者共同萃取的方式要高，但是高出的量并不多，因此若要更多地萃取出族群一化合物应该选择一阶段的萃取法，即在萃取开始即泵入乙酸乙酯与二氧化碳共同萃取。

族群二化合物在使用一阶段萃取法时得到的萃取量远高于两阶段萃取法，这可能是因为乙酸乙酯与石斛中的溶质分子更容易形成极性力、氢键或其他的化学键，增进了超临界流体溶剂对于溶质的溶解性。因此若要更多地萃取出族群二化合物同样应该选择一阶段的萃取法，即在萃取开始即泵入乙酸乙酯与二氧化碳共同萃取。但是在两阶段萃取时，泵入乙酸乙酯与二氧化碳共萃却未见该群族化合物较大幅度的增加，其中原因还有待更进一步的考察。

使用超临界二氧化碳添加夹带剂（乙酸乙酯）对齿瓣石斛进行萃取有效、方便、快速地将齿瓣石斛中成分萃取出，为以后齿瓣石斛化学成分的研究提供良好的基础。

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Extraction of chem ical com ponents from Dendrobium devonianum Paxt.by supercritical carbon dioxide

BAO Xiao-qing1，2， LIANG Ming-zai3， WU Zhi-gang2， TAO Zheng-ming2*， LIN Zhi-xiong3
（1.Wenzhou Medical Uniυersity，Wenzhou 325005，China；2.Zhejiang Institute for Subtropical Crops，Wenzhou 325005，China；3.Department of Chemical Engineering，I-Shou Uniυersity，Kaohsiung 84001，Taiwan，China）

Dendrobium deυonianum Paxt.；supercritical carbon dioxide extraction（SFE）；modifier；ethyl acetate

R284.2

A

1001-1528（2015）03-0530-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.015

2014-08-29

包晓青（1990—），女，硕士生，研究方向为天然药物的分离纯化。Tel：13587951484，E-mail：631356839@qq.com

陶正明，副研究员，主要从事中药资源工作。