DPP－4抑制剂和缬沙坦对糖尿病肾脏组织CTGF表达的影响

武红梅，邓丽萍，胡园园，沈明静，龙爱梅，黄莹

(深圳市龙岗中心医院，广东深圳 518116)

糖尿病肾病 (Diabeticnephropathy，DN)是糖尿病 (Diabetes mellitus，DM)常见和严重的慢性并发症，是导致终末期肾衰竭的主要原因之一，其确切发病机制目前尚未完全清楚，亦无特异性治疗方法。有关肾脏局部CTGF在DN表达的变化，研究报道还非常少见，且给予DPP－4抑制剂–维格列汀、血管紧张素受体拮抗剂－缬沙坦及联合阻抑DN的发生发展目前国内外尚无报道。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

健康雄性SD大鼠50只，2月龄，体质量180～200 g，主要试剂:链脉佐菌素 (STZ，厦门星隆达化学试剂有限公司)，DPP－4抑制剂维格列汀、缬沙坦 (诺华制药有限公司)，尿蛋白试剂盒 (购自南京建成科技有限公司)，血糖试纸 (美国强生公司生产)，CTGF、SP试验盒 (Ⅱ抗)、生物素标记羊抗兔IgG、DAB显色剂 (购自武汉博士德生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制作及分组 50只SD大鼠，单次腹腔注射65 mg/kg STZ，STZ用0.1 mmol/L无菌枸橼酸缓冲液配制 (pH=4.5)。待72 h以后，尾静脉取血测定血糖，血糖≥16.67 mmol/L的大鼠入组为糖尿病大鼠 (未成模8只，舍去)。连续4 w测定血糖、24 h尿蛋白，连续3 d随机血糖≥16.67 mmol/L，并且24 h尿蛋白＞30 mg/(kg·d)，糖尿病肾病 (DN)大鼠模型成立［1］，(未成模6只，舍去)。均不用药物干预。DN的大鼠36只再随机分为4组:DN组9只 (予等量PBS缓冲液皮下注射)、维格列汀治疗组 (VL)9只予8 mg/(kg·d)灌胃、缬沙坦治疗组 (VT)9只予30 mg/(kg·d)灌胃，联合用药组 (VV)9只，予8 mg/(kg·d)灌胃+30 mg/(kg·d)灌胃，治疗12 w。用代谢笼收集24 h尿，记录尿量，留取少量尿标本保存于－20℃冰箱待测尿蛋白，尾静脉采血测空腹血糖 (FBG)，腹腔静脉取血后，取出肾脏，置于10%中性福尔马林中固定，用于光镜与免疫组化。

1.2.2 各组大鼠生化指标测定 (1)尾静脉采血，强生血糖仪检测血糖;(2)代谢笼收集24 h尿液，723型可见分光光度计检测尿蛋白含量。

1.2.3 免疫组化检测肾组织CTGF蛋白表达 肾脏蜡块制成4 μm厚切片，按照试剂盒操作，最后进行脱水、透明、封片。在高倍镜下，依据染色面积和强度，随机取10个视野和肾小球，应用计算机图像分析软件，进行半定量分析，以阳性目标总面积与统计场总面积比值表示，阳性结果为棕黄色颗粒。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖、24 h尿蛋白的比较

见表1。

2.2 肾组织免疫组化

第12周，DN组:肾组织着色广泛、浓集，在肾小球系膜细胞区、肾小管上皮细胞、及间质区均有表达，以肾小球表现最为突出。与DN相比，维格列汀、缬沙坦组，着色范围相似，但程度明显减轻 (P＜0.05)，联合治疗组最为明显 (P＜0.01)，维格列汀、缬沙坦组两组间无统计学差异，但与联合治疗组比较 (P＜0.05)，见表2，图1。

表1 各组大鼠血糖、24 h尿蛋白的比较

表2 各组大鼠肾组织CTGF的平均光密度值()

表2 各组大鼠肾组织CTGF的平均光密度值()

注:VL、VT与DN组相比，*P＜0.05;VV与DN组相比，＊＊P＜0.01;VL与VV组相比，▲P＜0.05

分组 n CTGF DN 9 3.11±0.59 VL 9 1.92±0.24*VT 9 2.10±0.31*VV 9 1.20±0.12＊＊▲

3 讨 论

肠促胰素类药物是目前用于治疗2型糖尿病较新的一类药物，肠促胰素类药物有两类:一类是GLP－1(胰高血糖素样肽－1)类似物，一类是DPP－4(二肽基肽酶)抑制剂，它能通过抑制DPP－4的活性，减少DPP－4对GLP－1和GIP(葡萄糖依赖促胰岛素多肽)的降解，提高循环中的GLP－1和GIP水平，而GLP－1具有葡萄糖浓度依赖的促胰岛素分泌的特点，调节胰岛B细胞和a细胞对血糖的敏感性。有文献报道，GLP－1类似物艾塞那肽，能够延缓糖尿病肾病的进程［2］，同时发现在高糖状态下，GLP－1类似物艾塞那肽干预的人肾小球系膜细胞转化生子因子Bl和结缔组织生长因子的表达亦相应减少［3］。GLP－1受体激动剂对肾脏的保护作用在DPP－4抑制剂中也得到了证实，如在T1DM小鼠中，经DPP－4抑制剂治疗后，能够减少蛋白尿，改善肾脏组织学改变［4］。在T2DM小鼠中，DPP－4抑制剂西格列汀表现出了相似的肾保护效应［5］，阿格列汀联合ARB也能够显著减少尿蛋白。在人体研究中发现［6］，T2DM患者应用DPP－4抑制剂阿格列汀治疗24 w后，尿蛋白的排泄显著减少。

近年来，临床和动物实验证明，许多细胞生长因子对DN的发生和发展起着一定的作用。其中，研究较多的是转化生长因子TGF－β1，CTGF作为TGF－β1的下游因子，介导了TGF－β1的功能，促进细胞外基质积聚和肾组织纤维化等DN的特征性改变［7］，被认为对糖尿病肾损伤的进展起重要作用。我们的研究结果亦证明了这一点，本实验利用免疫组化检测了肾皮质CTGF的表达水平，结果显示，糖尿病大鼠肾组织CTGF表达明显增多，经维格列汀、缬沙坦治疗后糖尿病大鼠肾组织CTGF表达明显减少。

缬沙坦是非肽类 AngⅡ 拮抗剂 (angiotensin receptor blocter，ARB)类药物，主要通过拮抗受体AT1，抑制肾脏局部肾素－血管紧张素－醛固酮系统，降低肾小球内毛细血管压力，减少细胞生长因子及炎症介质，减轻肾脏细胞的增殖及细胞外基质的积聚，起到降低尿蛋白，保护肾功能的作用［8］。近来研究还显示，在早期DN患者应用缬沙坦能有效减少尿白蛋白排泄，保护其肾脏功能［9］。本实验也证实缬沙坦组能减少糖尿病肾病大鼠尿蛋白水平，且与维格列汀联合应用作用更显著。

本研究通过测定DN大鼠的血糖及24 h尿蛋白，观察肾小球的CTGF表达水平，证实糖尿病肾病大鼠肾组织中存在CTGF的高表达，DPP－4抑制剂维格列汀及ARB类缬沙坦可下调其表达，而其联合应用对其下调的作用更显著，而且本实验还发现随着糖尿病肾病肾组织CTGF表达水平的降低，尿蛋白也明显下降，提示降低糖尿病肾病肾脏CTGF高表达是其肾保护作用机制之一，DPP－4抑制剂维格列汀联合缬沙坦应用可能更有利于糖尿病肾病的治疗，为临床治疗糖尿病肾病提供了方向。

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图1 各组大鼠肾组织C TG F 的蛋白表达水平