ORP对酿酒酵母在木质纤维素水解液抑制物中发酵的影响

郝学密，杜斌，刘黎阳，刘晨光，白凤武



ORP对酿酒酵母在木质纤维素水解液抑制物中发酵的影响

郝学密，杜斌，刘黎阳，刘晨光，白凤武

（大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连116024）

木质纤维素水解液中的毒性副产物对酿酒细胞具有抑制作用，采用氧化还原电位(oxidoreduction potential, ORP)调控，能够提高细胞对抑制物的耐受性。考察了代表性抑制物乙酸、糠醛及苯酚对酵母细胞生长和代谢的影响，并通过添加氧化剂赤血盐(K3[Fe(CN)6])和还原剂二硫苏糖醇(DTT)调节发酵液ORP初始值在（305±5）mV、（157±8）mV及（-150±5）mV，研究不同ORP条件下细胞对抑制物的耐受性影响。结果表明，氧化态能提高生物量并缩短发酵时间。除苯酚外，氧化态也利于提高乙醇的收率。对细胞保护剂甘油合成的方面，氧化态和还原态都会促进甘油合成。在水解液脱毒方面，氧化态表现比还原态要好，因为氧化态促进生物量积累，有利于通过细胞自身代谢脱毒。

木质纤维素；抑制物；胁迫耐受性；氧化还原电位；脱毒

引 言

木质纤维素是地球上产量最大的可再生生物质资源，可用于生物燃料及生物基化学品的生产[1]。由于其组分纤维素、半纤维素和木质素相互缠绕，具有极强的顽抗特性，因此对木质纤维素物料的预处理就变得十分必要。在处理过程中一些毒性副产物生成，对后续发酵过程的菌体产生抑制作用，不利于生物转化的进行。

抑制物的种类和含量受木质纤维素来源和处理方式的影响，主要包括有机酸、呋喃衍生物和酚类物质。有机酸主要为乙酸，来自于半纤维素乙酰基的降解，在水解液中浓度可达10 g·L-1[2]。其他有机酸如甲酸和乙酰丙酸则是由糠醛和5-羟甲基糠醛（5-HMF）降解生成[3]。弱酸对细胞的抑制受其浓度影响，报道称当脂肪酸浓度超过100 mmol·L-1对酵母产生抑制作用，低于此值时反而可提高乙醇得率[4-5]。呋喃类主要是糠醛（furfural）和5-HMF，分别由戊糖和己糖在酸性环境下脱水生成。稀酸预处理的玉米芯水解液中糠醛浓度可达到3.2 g·L-1[6]，而糠醛浓度达到2.88 g·L-1时，酵母对葡萄糖利用就会明显延缓[7]。酚类化合物主要由木质素降解形成。虽然浓度只有mg·L-1级别，但对细胞的抑制作用非常明显[8]。

三类抑制物的作用机理各不相同。弱酸造成了胞内环境的酸化，必须通过消耗ATP将多余的质子泵出以维持胞内的中性环境，影响了细胞正常的能量供给[9]。糠醛等抑制物能抑制胞内的NAD(P)H的合成，或者加快其降解。而NAD(P)H/ NAD(P)+作为主要的辅因子，参与了细胞多个物质代谢和能量代谢过程[10]。酚类物质是强的蛋白变性剂，能够改变细胞膜上蛋白活性及与脂肪的比例，因此影响酵母细胞的正常功能[11]。

一般而言，解决副产物毒性有如下方法：① 改善预处理条件降低副产物的生成[12]；② 使用脱毒技术去除毒性副产物[13]；③ 通过筛选和基因工程等方法得到具有抑制物抗性的微生物[14-15]；④通过过程工程的手段提高细胞的抗性[16]。

氧化还原电位（oxidoreduction potential, ORP）调控能够从多个层面影响细胞的生理状态，从而提高酵母对高浓度乙醇发酵的胁迫耐受性[17]。同时通过基因芯片分析发现：ORP变化与HSP家族等多种环境胁迫响应通路表达有关[10]。因此，ORP调控是否也能提高细胞对木质纤维素水解液中抑制物的耐受性，是本文将要关注的重点。

1 材料和方法

1.1 菌株和发酵

菌种：ATCC 4126。

种子培养基（g·L-1）：葡萄糖30，酵母浸粉4，蛋白胨3。

发酵培养基（g·L-1）：葡糖糖100，酵母浸粉4，蛋白胨3。

菌种预培养：从斜面上接一环菌体于含有100 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，置于恒温摇床上，在30℃和150 r·min-1条件下培养18 h。

发酵培养：将活化后的种子培养液按10%接种于含100 ml发酵培养基的250 ml摇瓶中，起始接种菌种密度为OD620=0.25，置于恒温摇床上，在30℃、150 r·min-1条件下培养。在发酵过程中，未添加任何试剂的摇瓶培养24 h，每隔4～5 h取样2 ml分别存于1.5 ml离心管中，1 ml用于测OD620，1 ml用于测发酵产物组分。添加抑制物的试剂摇瓶培养60 h，每隔12 h取样一次。

1.2 ORP调控方式

使用pH计（Sartorius PB-10，Mettler Toledo，Switzerland）连接ORP电极（Pt4805-DPAS- SC-K8S/225，Mettler Toledo，Switzerland），将电极经酒精擦拭后插于发酵液中即可采集数据。在发酵培养基中分别添加氧化剂（oxidant，O）赤血盐（K3[Fe(CN)6]）16.9 g·L-1，还原剂(reductant，R)二硫苏糖醇（DTT）0.5 g·L-1调节初始ORP值分别为(305±5) mV和(-150±5) mV。不加氧化还原剂的为空白对照组（control，C），ORP值为(157±8) mV。

1.3 组分分析

生物量测定：使用酶标仪（Thermo labsystems Multiskan Ascent 354）测发酵液OD620值。

发酵液组分：发酵液经0.45mm亲水性微孔滤膜过滤后，使用高效液相色谱（Waters 410，Waters，MA，USA）分析发酵液中乙醇、葡萄糖、甘油、乙酸和糠醛的量。色谱柱为有机酸分析柱（300 mm×7.8 mm，Bio-Rad，Hercules，Aminex HPX-87H），进样量20ml，流动相为0.01 mmol·L-1硫酸溶液，流速为0.4 ml·min-1，示差检测器温度50℃，柱温50℃。

苯酚含量测定：使用气相色谱法进行分析。进样口温度250℃，柱温200℃，检测器温度为250℃，检测器为FID，色谱柱为毛细管玻璃柱Agilent HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.50mm），氢气流速40 ml·min-1，空气流速400 ml·min-1，载气氮气流速30 ml·min-1，进样量0.1ml，分流50:1，内标为苯甲醇。

2 结果与讨论

2.1 抑制物添加对细胞生长和发酵的影响

木质纤维素降解产生的毒性副产物有机酸、糠醛类和酚类物质对酵母生长抑制作用体现在最大生物量降低和达到最大生物量的时间延长。如图1所示，相对于没有抑制物添加的发酵过程，乙酸、糠醛和苯酚的添加使得生物量有明显降低。其中5 g·L-1乙酸，2 g·L-1苯酚添加后细胞几乎停止生长。4 g·L-1糠醛OD值仍能达到3.84左右，说明酵母细胞自身对糠醛的耐受性较好[18]。此外，无抑制物添加的生物量达到最大值只需20 h，而添加乙酸后需48～60 h，苯酚和糠醛需24～36 h，抑制物的添加显著降低了细胞的生长速率。

由图1(d)可知，抑制物浓度增加会降低细胞对葡萄糖的利用速度。在60 h的发酵时长内，5 g·L-1的乙酸，2 g·L-1及以上的苯酚都没有利用完葡萄糖，乙醇浓度也相应减少。但是乙酸和糠醛对细胞的影响主要是生物量上，对乙醇的收率影响较小。而苯酚的添加不仅改变了细胞的活性，还降低了乙醇的收率，改变了代谢通路的流量。

2.2 ORP对含乙酸体系细胞生长和发酵的影响

在3种乙酸添加浓度下，氧化态的发酵过程生物量有明显的提高，与对照组相比提高了11%～26%。还原态的细胞生长表现最差，生物量与对照组相比下降了10%～53%。5 g·L-1乙酸添加后生物量积累最少，即使在最优氧化态下，其生物量仅为0.73 g·L-1。因此，乙酸添加不超过4 g·L-1时葡萄糖在60 h内基本上都已经利用完毕，而当乙酸添加量为5 g·L-1时仍有53～83 g·L-1葡萄糖尚未使用。

由表1可知，在3 g·L-1的乙酸添加下，乙醇收率几乎没有改变。随着乙酸浓度的提高，4 g·L-1氧化态的乙醇得率得到提高，比空白提高了8.8%。ORP的改变使甘油收率均有所增加，这是细胞应对外界环境变化的行为，因为甘油是细胞内主要的保护物质[19]。对于乙酸添加不超过4 g·L-1的情况，还原态的甘油收率最高，比对照组提高了50%～57%，因为甘油生成需要NADH所提供的还原力，还原态的发酵环境利于提高NADH的含量。而5 g·L-1的乙酸添加后由于抑制太过强烈，60 h细胞尚未进入对数生长期，葡萄糖几乎未被利用，因此乙醇和甘油合成均不符合上述的规律。

表1 ORP调节下的乙酸对细胞生长和发酵的影响Table 1 Effect of ORP on yeast growth and fermentation under acetic acid

2.3 ORP对含糠醛体系细胞生长和发酵的影响

糠醛影响酵母内部的氧化还原平衡。由表2可见，与乙酸添加相类似，糠醛抑制下的生物量在氧化态情况下出现了最高，而在还原态下减小。比没有氧化还原剂添加的对照组分别提高10%～21%和下降21%～45%。在此浓度下，糠醛对细胞的抑制效果较小，生物量均维持在较高水平，因此60 h内的葡萄糖都消耗完毕，而乙醇的收率变化不明显。

表2 ORP调节下的糠醛对细胞生长和发酵的影响Table 2 Effect of ORP on yeast growth and fermentation under furfural

Note: Glucose residue were 0 for all experiments after 60 h.

乙醇的收率在氧化态下较高，而还原态与空白对照的收率相近。随着糠醛的加入量增多，甘油的合成量在下降。这是由于糠醛会消耗细胞内的还原力，竞争性地抑制甘油的合成[20]。在相同糠醛抑制物的环境下，氧化态和还原态的环境都会使甘油的合成量增加，但有趣的是，氧化态的甘油合成得略多一些。可能与氧化态利于糠醛去除有关[21]。

2.4 ORP对含苯酚体系细胞生长和发酵的影响

在木质纤维素降解产生的多种抑制物中，酚类化合物对发酵的抑制作用最强，并且低分子量酚类化合物毒性最强[6]。如表3所示，苯酚的添加量从1 g·L-1增加到2 g·L-1后，细胞生长能力骤降，OD620由3.3左右降至0.55左右。在同一苯酚浓度下，氧化态的生物量最高，相比于空白对照提高了5%～10%，而还原态的生物量与对照组相比较相近或下降。2 g·L-1以上生物量就已出现了明显的下降，因此葡萄糖在60 h内并未完全用完。

表3 ORP调节下的苯酚对细胞生长和发酵的影响Table 3 Effect of ORP on yeast growth and fermentation under phenol

苯酚浓度升高导致乙醇收率下降，而ORP调控对乙醇收率无显著影响。在添加1 g·L-1苯酚的情况下，氧化剂和还原剂的添加均有利于甘油合成，相比于空白对照组提高了10%～20%。而当苯酚浓度提高后（≥2 g·L-1），由于细胞长时间处于停滞期，造成甘油收率并不存在明显规律。氧化还原剂可以通过直接的化学反应去除苯酚分子[16,22]。

2.5 ORP调控下细胞对抑制物的脱毒作用

通过酵母自身代谢，ORP调控能够实现发酵过程的原位脱毒。乙酸为乙醇发酵副产物，发酵后会少量产生，如果发酵初期加入乙酸，反而会被细胞吸收脱除。如图2（a）所示，细胞在氧化态和还原态下对乙酸的利用较好，脱毒率分别为0.167～0.304（氧化态）和0.105～0.173（还原态），尤其是在添加乙酸浓度较低时效果更佳。而细胞在空白状态下脱去乙酸能力最差，仍可观察到乙酸浓度的积累（脱毒率为负值）。这与生物量关系符合较好，氧化态生物量高，乙酸脱毒率高；还原态生物量低，乙酸脱毒率低。

酿酒酵母可以将酚类转化为毒性较小的醇类物[23]，而氧化还原剂的添加有利于进一步帮助细胞去除酚类。如图2（b）所示，加入氧化还原试剂的发酵比空白对照组的脱毒效果好，这与已报道的脱毒结果相一致[16]。值得注意的是，1 g·L-1苯酚添加后，氧化态脱毒能力比还原态高60%，脱毒率接近100%。氧化还原剂直接发生反应所去除的苯酚量较少，因为可以明显看到[图2（b）]，相同氧化还原剂添加，对苯酚的去除率却有极大的差异，这反映出在苯酚去除的过程中，细胞生物量和活性才是决定脱毒效果的关键，对比表3生物量的数据，同样存在有生物量大，脱毒率大的关系。

细胞对糠醛的脱毒效果最好，在规定发酵时间内其脱毒率皆为100%，糠醛被转化为糠醛醇[7]。但不同ORP条件下脱毒率到达100%的时刻却有所不同，分别为48 h（C）、24 h（O）和24 h（R）。NADH及依赖于NADH的氧化还原酶能够帮助去除糠醛[24-25]，而调节ORP可以调控胞内NADH/ NAD+的比值，赋予细胞很好的糠醛脱毒能力。

3 结 论

本文通过添加氧化剂赤血盐和还原剂DTT调控发酵体系ORP，考察了酵母细胞在3种典型木质纤维素水解液抑制物乙酸、糠醛及苯酚中的发酵性能。得到如下结论。

（1）抑制物的添加降低了生物量，进一步使葡萄糖利用和终点乙醇浓度降低，但是糠醛和乙酸不会影响代谢分布，而苯酚使得乙醇收率降低。

（2）在抑制物存在的情况下，氧化态可以提升生物量，进而改善发酵结果。除苯酚外，氧化态的环境有利于提高乙醇收率。在添加氧化还原剂后甘油合成得到了促进。对于乙酸浓度超过5 g·L-1，苯酚浓度大于2 g·L-1的情况，由于细胞几乎没有生长，因此ORP调控并没有明显的规律性。

（3）进行ORP调控有利于脱除抑制物。氧化还原剂的加入会直接与抑制物发生化学作用，但更多的是促进酵母细胞通过自身代谢去除抑制物。

References

[1] Metzger Jürgen O, Hüttermann Aloys. Sustainable global energy supply based on lignocellulosic biomass from afforestation of degraded areas [J]., 2009, 96(2): 279-288

[2] Hasunuma Tomohisa, Sanda Tomoya, Yamada Ryosuke, Yoshimura Kazuya, Ishii Jun, Kondo Akihiko. Metabolic pathway engineering based on metabolomics confers acetic and formic acid tolerance to a recombinant xylose-fermenting strain of[J]., 2011, 10(1): 2-13

[3] Jönsson L J, Alriksson B, Nilvebrant N O. Bioconversion of lignocellulose: inhibitors and detoxification [J]., 2013, 6(1): 16

[4] Larsson Simona, Palmqvist Eva, Hahn-Hägerdal Bärbel, Tengborg Charlotte, Stenberg Kerstin, Zacchi Guido, Nilvebrant Nils-Olof. The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood [J]., 1999, 24(3): 151-159

[5] Horváth Ilona Sárvári, Sjöde Anders, Alriksson Björn, Jönsson Leif J, Nilvebrant Nils-Olof. Critical conditions for improved fermentability during overliming of acid hydrolysates from spruce [J]., 2005,124(1/2/3): 1031-1044

[6] Li Hongxing(李洪兴), Zhang Xiaoran(张笑然), Shen Yu(沈煜), Dong Yongsheng(董永胜), Bao Xiaoming(鲍晓明). Inhibitors and their effects onand relevant countermeasures in bioprocess of ethanol production from lignocellulose—a review [J].(生物工程学报), 2009, 25(9): 1321-1328

[7] Liu Z L, Slininger P J, Dien B S, Berhow M A, Kurtzman C P, Gorsich S W. Adaptive response of yeasts to furfural and 5-hydroxymethylfurfural and new chemical evidence for HMF conversion to 2,5-bis-hydroxymethylfuran [J]., 2004, 31(8): 345-352

[8] Zhuang Junping(庄军平), Lin Lu(林鹿), Pang Chunsheng(庞春生), Liu Ying(刘颖) , Sun Yong(孙勇).Research advances in detoxification of lignocellulose hydrolysates-making [J].(现代化工), 2009(2): 19-23

[9] Hyland P B, Mun S L S, Mahadevan R. Prediction of weak acid toxicity inusing genome-scale metabolic models [J]., 2013, 9(4): 229-235

[10] Liu Chenguang, Xue Chuang, Lin Yenhan, Bai Fengwu. Redox potential control and applications in microaerobic and anaerobic fermentations [J]., 2013, 31(2): 257-265

[11] Keweloh H, Weyrauch G, Rehm H J. Phenol-induced membrane changes in free and immobilized[J]., 1990, 33(1): 66-71

[12] Pienkos P T, Zhang M. Role of pretreatment and conditioning processes on toxicity of lignocellulosic biomass hydrolysates [J]., 2009, 16(4): 743-762

[13] Parawira W, Tekere M. Biotechnological strategies to overcome inhibitors in lignocellulose hydrolysates for ethanol production: review [J]., 2011, 31(1): 20-31

[14] Larsson S, Cassland P, Jönsson L J. Development of astrain with enhanced resistance to phenolic fermentation inhibitors in lignocellulose hydrolysates by heterologous expression of laccase [J]., 2001, 67(3): 1163-1170

[15] Gorsich S W, Dien B S, Nichols N N, Slininger P J, Liu Z, Skory C D. Tolerance to furfural-induced stress is associated with pentose phosphate pathway genes ZWF1, GND1, RPE1, and TKL1 in[J]., 2006, 71(3): 339-349

[16] Alriksson B, Cavka A, Jönsson L J. Improving the fermentability of enzymatic hydrolysates of lignocellulose through chemicaldetoxification with reducing agents [J]., 2011, 102(2): 1254-1263

[17] Wang Na(王娜), Liu Chenguang(刘晨光), Yuan Wenjie(袁文杰). ORP control on very high gravity ethanol fermentation [J].(化工学报), 2012, 63(4): 1168-1174

[18] Cavka Adnan, Alriksson Björn, Ahnlund Maria, Jönsson Leif J. Effect of sulfur oxyanions on lignocellulose-derived fermentation inhibitors [J]., 2011, 108(11): 2592-2599

[19] Brown A. Microbial water stress [J]., 1976, 40(4): 803

[20] Horváth Ilona Sárvári, Taherzadeh Mohammad J, Niklasson Claes, Lidén Gunnar. Effects of furfural on anaerobic continuous cultivation of[J]., 2001, 75(5): 540-549

[21] Ren Baixiang(任百祥), Yang Chunwei(杨春维), Teng Honghui(滕洪辉). Research on degradation of furfural wastewater by utrasonic wave [J].(环境工程学报), 2007, 1(10): 68-70

[22] Soudham V P, Alriksson B, Jönsson L J. Reducing agents improve enzymatic hydrolysis of cellulosic substrates in the presence of pretreatment liquid [J]., 2011, 155(2): 244-250

[23] Larsson Simona, Quintana-Sáinz Alexis, Reimann Anders, Nilvebrant Nils-Olof, Jönsson Leif J. Influence of lignocellulose-derived aromatic compounds on oxygen-limited growth and ethanolic fermentation by//Twenty-First Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals[C]. Springer, 2000: 617-632

[24] Heer D, Heine D, Sauer U. Resistance ofto high concentrations of furfural is based on NADPH-dependent reduction by at least two oxireductases [J]., 2009, 75(24): 7631-7638

[25] Wahlbom C F, Hahn-Hägerdal B. Furfural, 5-hydroxymethyl furfural, and acetoin act as external electron acceptors during anaerobic fermentation of xylose in recombinant[J]., 2002, 78(2): 172-178

Effect of ORP regulation on yeast fermentation with inhibitors of lignocellulose hydrolysate

HAO Xuemi, DU Bin, LIU Liyang, LIU Chenguang,BAIFengwu

School of Life Science and BiotechnologyDalian University of TechnologyDalianLiaoningChina

A broad range of inhibitors in hydrolysate of lignocellulose, including weak acids, furan derivatives and phenolic compounds restrain yeast growth and subsequent fermentation. The effect of oxido-reduction potential (ORP) regulation on yeast cell tolerance to the presence of acetic acid, furfural and phenol was investigated. Cell growth and metabolite distribution changed under different ORP levels [(305±5) mV, (157±8) mV and (-150±5) mV] by feeding oxidant (potassium ferricyanide, K3[Fe(CN)6]) and reductant (dithiotreitol, DTT). Compared to the control group, cell growth was enhanced, and ethanol yield increased except for phenol group. The yield of glycerol was enhanced under both oxidizing and reducing conditions, since glycerol was a main protective molecule in yeast. High ORP level facilitated detoxification of inhibitors thanks to high biomass accumulation.

lignocellulose; inhibitors; stress tolerance; ORP; detoxification

2014-08-28.

LIU Chenguang, cg_liu@dlut.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141318

Q 815

A

0438—1157（2015）03—1066—06

国家自然科学基金项目（21406030）；中国博士后科学基金特别资助项目（2013T60286）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（DUT14QY19）；辽宁省博士科研启动基金项目（20141027）。

2014-08-28收到初稿，2014-11-30收到修改稿。

联系人：刘晨光。第一作者：郝学密（1989—），女，硕士研究生。

supported by the National Natural Science Foundation of China(21406030), the China Postdoctoral Science Special Foundation (2013T60286), the Fundamental Research Funds for Central Universities (DUT14QY19) and the Liaoning Province Doctor Startup Fund (20141027).