线粒体乙醛脱氢酶2突变型基因的心肌保护作用

张裕坚，金周晟，陈鸿飞，吴一泉，徐旭仲

（1.温州医科大学附属第一医院　麻醉科，浙江　温州　325015；2.北京阜外医院　小儿心脏外科，北京100037）

线粒体乙醛脱氢酶2突变型基因的心肌保护作用

张裕坚1，2，金周晟1，陈鸿飞1，吴一泉1，徐旭仲1

（1.温州医科大学附属第一医院麻醉科，浙江温州325015；2.北京阜外医院小儿心脏外科，北京100037）

目的：观察施行心脏手术的患者，携带线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）突变型基因对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法：将北京阜外医院小儿心脏外科71例施行法洛四联症根治术的患者根据ALDH2基因型检测结果分成2组：突变型组（携带ALDH2*2突变型基因）和野生型组（携带ALDH2*1野生型基因）。收集术中切除的右心室流出道心肌组织，采用分光光度计法检测ALDH2酶活性，丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量。体外循环升主动脉开放后20 h取血检测心肌肌钙蛋白值（cTnI）。结果：突变型组患者术中缺血心肌组织毒性醛类MDA含量更低（P=0.013），心肌保护物质GSH含量更高（P=0.011），并且突变型组患者术后有更低的cTnI值（P=0.015），更短的术后住院时间（P=0.017）。结论：携带ALDH2突变型基因可以明显降低术中缺血心肌组织毒性醛类物质的堆积，提高心肌组织GSH含量，并且具有更好的临床预后，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。

线粒体乙醛脱氢酶2；心脏手术；缺血再灌注损伤；心肌保护

1.1一般资料 选择2014年2月-2014年12月在北京阜外医院施行法洛四联症根治术的患者71例，手术均由一位主任医师主刀完成。所有病例均无术前呼吸支持及术前正性肌力药物的使用史，排除术中需主动脉二次阻断以及术后并发严重感染的病例。所有病例均经由北京阜外医院伦理委员会同意并签署患者家属知情同意书。根据基因检测结果，将实验分为2组：突变型组（携带ALDH2*2突变型基因）26例，男16例，女10例；野生型组（携带ALDH2*1野生型基因）45例，男29例，女16例。2组患者年龄、体质量、主动脉骑跨率、室间隔缺损大小、术前经皮氧饱和度、体外循环时间、主动脉阻断时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　2组患者临床资料比较

表1　2组患者临床资料比较

项目　　突变型组（n=26）野生型组（n=45）　P年龄（月）　10.0± 3.0　11.0± 4.0　0.166体质量（kg）　8.7± 1.4　9.5± 2.6　0.141主动脉骑跨率（%）　45.0± 4.0　44.0± 4.0　0.734室间隔缺损大小（mm）　12.3± 2.5　11.5± 2.2　0.337术前经皮氧饱和度（%）　82.0± 6.0　83.0± 5.0　0.431体外循环时间（min）　117.0±21.0　123.0±24.0　0.328主动脉阻断时间（min）　81.0±22.0　91.0±27.0　0.118

1.2基因测序 患者麻醉后经由深静脉导管取血1 mL，EDTA抗凝，-80 ℃低温冰箱保存。采用等位基因特异性PCR法检测ALDH2基因型［7］。主要过程如下：将患者静脉血使用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA，提取物于4 ℃保存，获取DNA后通过聚合酶链反应扩增目的DNA片段，扩增引物上游5’-AAAATAAAGACTTTGGG GCAATA-3’，下游5’-CTTAAAATGGGAAATTAGTAGGAA AC-3’，按模板DNA 2 µg 2*MasterMix 25 µL（包括0.1 uTaqDNA Polymerase，500 mmol Tris-Hcl pH 8.7，20 mmol KCl，4 mmol MgCl），引物2 µL，双蒸水补足配成50 µL反应体系，在ABI7000荧光定量PCR仪上扩增，先95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，扩增35个循环，再72 ℃延伸10 min，最后4 ℃收集产物保存，目标片段长度200 bp。使用DNA纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）通过反复吸附、离心等步骤收集DNA。基因测序我们使用ABI3730x1毛细管测序仪（北京博尚生物科技有限公司），根据ALDH2基因多态性关键SNP位点突变G-A，通过分析测序图确定ALDH2野生型基因和突变型基因。

1.3标本收集和检测

1.3.1心肌组织：收集法洛四联症根治术中切除的患者右心室流出道心肌组织，采用简单随机抽样法分别从2组患者心肌组织中随机抽取15例样本，使用分光光度计法分别检测ALDH2酶活性以及MDA、GSH含量［8］。通过裂解、震荡、离心等步骤制备样品，使用分光光度仪检测计算。

1.3.2血液cTnI：2组患者分别均在体外循环升主动脉开放后20 h经由颈内静脉导管取血2 mL，使用Bayer ACS 180检测系统自动检测cTnI值，检测试剂由Bayer公司提供。

1.4术后住院时间 查阅患者术后病历资料，记录2组患者术后住院时间。

1.5统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，采用两独立样本t检验，计数资料采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血液cTnI值 突变型组为（14.87±4.05）ng/ mL，野生型组为（17.46±4.68）ng/mL，突变型组显著低于野生型组，2组比较差异有统计学意义（P= 0.015）。

2.2心肌组织ALDH2酶活性、MDA、GSH含量 ALDH2酶活性2组比较差异无统计学意义（P=0.214），MDA含量突变型组显著低于野生型组（P=0.013）。GSH含量突变型组显著高于野生型组（P=0.011）。见表2。

表2　2组患者心肌组织检测结果比较（n=15，

表2　2组患者心肌组织检测结果比较（n=15，

与野生型组比：aP＜0.05

组别　ALDH2活性（U/mg）MDA含量（µg/mg）GSH含量（nmol/mg）突变型组　0.58±0.15　3.02±0.83a　0.31±0.05a野生型组　0.60±0.12　3.74±1.18a　0.20±0.06a

2.3术后住院时间 术后住院时间≥14 d的例数突变型组（为1例）显著少于野生型组（共12例），差异有统计学意义（P=0.017）。

3　讨论

ALDH2酶是醛类代谢的关键酶，并且在心肌组织中高度表达。经研究发现激活ALDH2酶活性可以降低大鼠心肌缺血损伤，其机制与ALDH2酶代谢缺血心肌中的毒性醛类物质有关［9］。也有研究通过大鼠转基因人ALDH2突变型基因，发现携带ALDH2突变型基因的大鼠心肌更能耐受缺血再灌注损伤［10］。在临床上，对于携带不同ALDH2基因型人群，是否存在上述动物实验的差异，是本研究的重点。

我们之所以选择法洛四联症患者，是因为该疾病是临床上较常见的先天性心脏病，且具有较为统一的解剖缺陷基础。术中我们收集到了施行法洛四联症手术患者右室流出道切除的心肌组织，进行了MDA和GSH含量的检测分析。MDA是机体脂质过氧化作用的产物，相对于活性氧自由基具有更长的半衰期以及更强的心脏毒性［11］，它的高低间接反映了心肌细胞受自由基攻击的严重程度，是评价心肌损伤的常用指标［12］。本研究中突变型组MDA含量显著降低，说明突变型组心肌组织中能够产生损伤的毒性物质更少。GSH对防止心肌缺血再灌注损伤的发生、发展有着非常重要的作用，其通过直接消除氧自由基、抑制钙超载、抗凋亡等作用产生心肌保护［13］，突变型组心肌组织GSH含量显著增加。

在本研究中我们观察到ALDH2突变型基因携带患者，在经过体外循环心肌缺血再灌注打击后，心肌损伤程度更低，具有更良好的临床预后。cTnI是目前临床上评价心肌损伤的特异性以及敏感性最高的指标，术后4～6 h升高，20 h左右达到最高值，术后20 h对cTnI值的检测可以作为心脏手术围术期并发症的独立危险因素［14］。术后住院时间的长短也能客观地反映患者术后的恢复情况，在北京阜外医院施行法洛四联症根治手术的患者平均住院天数是7～10 d，≥14 d被认定为出院延迟。在本实验中，突变型组病例术后20 h cTnI值、术后住院天数≥14 d的比率均显著高于野生型组。这些临床资料表明突变型组预后较好。

然而，我们在肌组织ALDH2酶活性的检测中发现，野生型组和突变型酶活性差异无统计学意义（P= 0.214），这与正常生理情况下不同基因型编码酶的活性有显著差异的情况不同。可能原因是：体外循环导致术中心肌的缺血损伤，并且产生大量的醛类物质堆积，醛类物质对ALDH2有很强的抑制作用，ALDH2的抑制又使其对醛类物质的代谢减少，进而又加重醛类物质对ALDH2活性的抑制作用，产生恶性循环，再加上术中低温环境对ALDH2酶活性的干扰［15］，最终导致野生型和突变型组在心肌ALDH2酶活性比较上差异无统计学意义。那么ALDH2突变型基因是通过哪种物质诱导GSH表达增加进而产生心肌保护作用的？这为我们进一步的实验埋下了伏笔，我们亦将对该机制进行进一步研究。

总之，我们通过本实验发现携带ALDH2突变型基因对体外循环术后心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与抑制毒性MDA含量，增加保护物质GSH含量有关。基于该发现，在临床上将来有可能针对携带不同ALDH2基因型患者，采取不同的术前“预处理”，个体化治疗，以期达到对围术期心肌缺血再灌注损伤的保护。

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（本文编辑：胡苗苗）

Effect of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 genotype on cardio-protection in patients with ischemia-reperfusion injury

ZHANG Yujian1，2， JIN Zhousheng1， CHEN Hongfei1， WU Yiquan1， XU Xuzhong1. 1.Department of Anesthesiology， the First Affiliated of Hospital Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015；2.Center for Pediatrict Cardiac Surgery， Fuwai Hospital， Beijing， 100037

Objective: To investigate the protection of human mitochondrial aldehyde dehydrognase 2 gene mutations for patients undergone cardiopulmonary bypass （CPB）. Methods: A prospective cohort of TOF patients （n=71） was recruited to investigate the influence of the ALDH2*2 allele on cardio-protection after surgical repair. The patients were divided into 2 groups: ALDH2*2 （n=45） and ALDH2*1 （n=26）. The right atrial appendage was harvested. ALDH2 activity， MDA and GSH were analysed. The cTnI was tested 20 hours later after the surgery. The time in hospital were recorded. Results: ALDH2*2 carriers showed highter GSH. ALDH2*2 carriers showed lower MDA， cTnI， and shorter postoperative length of hospital stay. Conclusion: ALDH2*2 allele has a myocardial protection effect after ischemic reperfusion injury， it may associated with greater expression of GSH level.

human mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2； cardiopulmonary bypass； ischemic reperfusion injury； myocardial protection

Q319.1

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.006

1资料和方法

2015-04-07

张裕坚（1984-），男，福建古田人，住院医师，硕士。

徐旭仲，教授，主任医师，硕士生导师，Email：xuzhong@263.net。

心肌缺血再灌注损伤是导致心脏手术高风险、高病死率的常见原因［1］，临床上需要一种新的心肌保护方案来降低心脏手术风险。目前研究证实醛类是导致缺血再灌注损伤的重要原因，因此机体对醛类物质的代谢显得尤为重要［2］。线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）是醛类代谢的关键酶［3］，人编码ALDH2酶的基因在504位点上存在单核苷酸多态性，由此导致突变型基因（编码酶活性降低或丧失）和野生型基因（编码酶活性正常）的差异［4］。40%的东亚人携带突变型基因［5］，这部分人群是否会由于编码的酶活性降低导致对醛类物质代谢减少，加重缺血心肌损伤，目前还没有定论［6］。本实验旨在通过收集施行法洛四联症根治术患者心肌组织，检测心肌氧化应激损伤指标丙二醛（MDA）和心肌保护通路关键因子还原型谷胱甘肽（GSH）含量，结合患者术后住院时间，观察携带突变型基因的心肌保护作用。