猪伪狂犬病病毒在不同细胞中增殖情况的比较

高英

（辽宁省北镇市动物疫病预防控制中心，辽宁 北镇 121300）

猪伪狂犬病病毒在不同细胞中增殖情况的比较

高英

（辽宁省北镇市动物疫病预防控制中心，辽宁 北镇 121300）

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（PRV）引起的以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要特征的急性传染病。随着中国规模化和集约化养猪业的发展，从国外引进的种猪相应增多，伪狂犬病随之传入并不断蔓延扩大，给养猪业造成了巨大的经济损失，中国将其列为二类传染病。由于PRV目前尚无有效的药物治疗方法，因此，该病的预防免疫就显得更为重要。PRV在细胞上繁殖的效率影响着疫苗的免疫质量，因此本实验将PRV在ST、BHK-21、PK-15、Vero上的增殖情况进行比较，筛选出适合PRV增殖的细胞，为猪伪狂犬病疫苗的生产提供优质抗原。

1　材料与方法

1.1细胞及病毒

猪睾丸传代细胞（ST）、BHK-21细胞、猪肾传代细胞（PK-15）、非洲绿猴肾传代细胞（Vero）均由本实验室保存。

猪伪狂犬病病毒PRV由本实验室分离鉴定并保存。

1.2试剂

DMEM、新生犊牛血清均购自GIBCO公司。

1.3方法

1.3.1病毒增殖将培养的ST、BHK-21、PK-15、MVero等细胞置于显微镜下观察，待细胞长成致密单层后即可用于病毒繁殖。每种细胞取三瓶，弃去生长液，两瓶用于病毒增殖，一瓶作为对照。每个细胞瓶中按维持液的1%接种PRV病毒，置于37℃孵育1h，弃去病毒液，每瓶加入10mL含2%新生犊牛血清的维持液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每天观察细胞病变情况，当80%细胞发生病变时收毒，将细胞瓶置于-20℃冰箱中反复冻融3次，保存于-70℃备用。

1.3.2病毒含量测定用DMEM培养液将病毒液作10倍系列稀释，即10-1、10-2……10-8，分别取100μL加至96孔细胞培养板，每个稀释度作6个重复，然后，每孔加入100μL经胰蛋白酶-EDTA消化分散的BHK21细胞悬液，并设正常细胞对照，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，逐日观察细胞病变和细胞对照，观察2～4d，记录细胞病变的孔数，并按照Reed-Muench法计算病毒液的TCID50。

2　结果

2.1细胞病变情况

表1　各种细胞病变情况

2.2病毒含量（TCID50）测定结果

由表2可以看出PRV在BHK-21细胞上增殖的病毒含量较高，达到108.6 TCID50/mL，在PK-15细胞上增殖较慢，仅为107.2 TCID50/mL。

表2　PRV在不同细胞中的TCID50

3　讨论

PRV能在多种细胞中增殖，但是在不同细胞上增殖的病变和病毒含量具有较大差异，选择一种最合适的细胞进行增殖不仅省时、省力，而且能得到较高纯度的抗原，为疫苗的生产提高了工作效率。本实验探索PRV在ST、BHK-21、PK-15 和Vero四种细胞上增殖的情况，筛选出一种较适合PRV增殖的细胞。PRV在BHK-21细胞上出现病变的时间较早，并且病变细胞圆缩，聚集，呈拉网状，易于判断，病毒含量也较高，能够达到108.6 TCID50/mL，在生产上即省时，又能获得较高的抗原浓度；所以在实际的生产实践中，BHK-21细胞可以作为PRV增殖的理想细胞。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.077