冻融-超声提取高三萜酸含量山楂汁的工艺条件优化

刘　慧，张春岭，陈大磊，吕真真，杨文博，焦中高*

（中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

冻融-超声提取高三萜酸含量山楂汁的工艺条件优化

刘慧，张春岭，陈大磊，吕真真，杨文博，焦中高*

（中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

为了优化提高山楂汁中三萜酸含量的工艺条件，分析冷冻时间、超声温度、超声时间和超声功率对山楂汁中三萜酸含量的影响。确定高三萜酸含量的山楂汁制备最佳工艺条件为：冷冻20 h，超声温度50℃，超声功率150 W，超声提取40 min。在优化条件下提取的山楂汁中三萜酸含量为341.18 mg/100 g，冻融-超声提取是一种制备高含量三萜酸山楂汁的有效技术。

山楂汁；三萜酸；超声提取；冻融

山楂（Rataegus pinnatifidaBge.）又名山里红、红果，属蔷薇科山楂属落叶乔木。果实富含山楂酸、柠檬酸、维生素C、三萜类、黄酮类、多酚类、原花青素等多种生物活性成分［1-5］。其中三萜类物质含量在水果中名列前茅，已经被证实具有助消化、降血脂、抗心肌缺血、强心、增强免疫功能、抗肿瘤等作用，引起国内外学者的关注［5-7］。

山楂已经有多种加工制品，其中山楂汁营养丰富、色泽艳丽、具有多种功效，已有较多相关研究［8-10］。超声波辅助酶法制备果汁具有操作简单快速、提取率高、可以保持活性成分等优势［11-13］，在果汁加工过程中可以降低果汁黏性，利于果浆细化，提高出汁率［14-15］，但用于山楂汁制备未见研究报道。此外，将果实进行冷冻-融化前处理已经被证实有利于果汁制备过程中活性成分的溶出［10，16］。本研究以三萜酸含量为主要考察指标，采用鲜山楂冷冻融化-超声辅助酶法提取山楂汁的方法，优化得到高效制备高品质山楂汁的工艺条件，进而为改进山楂汁生产工艺、提高山楂汁产品质量提供技术支持及理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜山楂，无病虫害、无畸形果，完熟期采摘，由河南省登封市惠农山楂专业合作社提供；齐墩果酸标准品：中国药品生物制品检定所；果胶酶（酶活30 000 U/g）：广州奇云生物技术有限公司；无水乙醇、甲醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯等均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

JYL-350料理机：九阳股份有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器（40 kHz）：昆山市超声仪器有限公司；Specord50紫外分光光度计：德国Analytic Jena公司；L-550台式离心机：湖南湘仪仪器开发有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；PAL-1手持糖度计：日本ATAGO公司。

1.3试验方法

1.3.1山楂汁制备工艺流程及操作要点

山楂→切片→去核→冷冻→解冻→匀浆→加酶→超声提取→离心→山楂汁

鲜果切成5 mm山楂片，去核，为防止褐变，切片后立即放置在-18℃冰箱开始冷冻计时。冷冻时间结束后，将山楂片取出加水匀浆。按质量比添加1.0‰的果胶酶，在相应试验条件下超声处理。提取结束后，4000r/min离心10min，收集上清液为山楂汁。

1.3.2测定指标

（1）可溶性固形物

可溶性固形物（soluble solid content，SSC）含量在（20±0.5）℃条件下用PAL-1手持糖度计测定。

（2）三萜酸提取及含量测定

参考罗小凤等［7］方法超声提取山楂汁中三萜酸，取2 g山楂汁于离心管中，加入4 mL体积分数为95%乙醇，30℃超声10 min，9 000 r/min离心10 min，收集上清液，残渣重复提取1次，合并两次上清液定容至10 mL；用香草醛-冰乙酸比色法［17］测定三萜酸含量，取1.0 mL样液于具塞试管中，加热挥去溶剂，之后加入5%香草醛-冰乙酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL摇匀，在70℃水浴恒温15 min，冷却至室温，加入8.0 mL乙酸乙酯，充分摇匀，在波长560 nm处测定吸光度值。以齐墩果酸为标准品，绘制标准曲线，以标准曲线回归方程计算样液中三萜酸含量。

1.3.3单因素试验

取50 g山楂切片，置于250 mL三角瓶中，加入150 mL水，在不同超声条件下制备山楂汁，以山楂汁中三萜酸含量为评价指标，通过单因素试验确定冷冻时间、超声温度、超声时间、超声功率的较佳值。

1.3.4正交优化试验

在单因素试验的基础上，以三萜酸含量为评价指标，采用L9（34）正交试验对冻融-超声辅助提取山楂汁的工艺进行优化。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1冷冻时间对山楂汁三萜酸含量的影响

分别将山楂切片冷冻0、5 h、10 h、15 h、20 h，取出后匀浆、加酶，在50℃、150 W功率条件下，超声30 min制备山楂汁。测定山楂汁SSC和三萜酸含量，结果如图1所示。

由图1可知，将山楂冷冻一定时间可以有效增加山楂汁中SSC及三萜酸含量。冷冻处理形成的冰晶会破坏细胞壁，使得组织液更易完全释放，增加山楂果实细胞内物质的溶出［10，18］。细胞壁内外表面温度变化速度不同，冷冻-解冻过程中胞壁两面产生很大温差，这种冲击热应力会引起断裂现象，增加活性物质的释放量［19］。当冻结时间为15 h时，三萜酸含量和SSC达到最大值，分别为330.99 mg/100 g和5.20%。因此，选择15 h为冷冻时间最佳点。

图1　冷冻时间对山楂汁可溶性固形物（A）及三萜酸（B）含量的影响Fig.1 Effect of freezing time on soluble solid content（A）and tritepenoidic acid content（B）in hawthorn juice

2.1.2超声温度对山楂汁三萜酸含量的影响

将山楂切片冷冻15 h，匀浆加酶后分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下，150 W功率超声30 min制备山楂汁。测定山楂汁SSC和三萜酸含量，结果如图2所示。

图2　超声温度对山楂汁可溶性固形物（A）及三萜酸（B）含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic extract temperature on soluble solid content（A）and tritepenoidic acid content（B）in hawthorn juice

由图2可知，随着超声温度的升高SSC变化不存在显著差异，超声温度为60℃时，SSC达到最大值5.21%。而三萜酸含量在30～50℃时，从299.18 mg/100 g显著增加到331.54 mg/100 g，之后随着温度升高有所下降。超声产生的剧烈振动可促进细胞破裂，和酶提取联用可以明显加速细胞内容物的溶出，降低提取温度，缩短提取时间，提高提取率［20-21］。但是温度升高一方面造成酶活性降低，另一方面高温作用下超声对生物活性物质结构有破坏。因此，选择50℃为温度最佳点。

2.1.3超声时间对山楂汁三萜酸含量的影响

将山楂切片冷冻15h，匀浆加酶后在50℃条件下，150 W功率分别超声10 min、20 min、30 min、40 min、50 min制备山楂汁。测定山楂汁SSC和三萜酸含量，结果如图3所示。

图3　超声时间对山楂汁可溶性固形物（A）及三萜酸（B）含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic extract time on soluble solid content（A）and tritepenoidic acid content（B）in hawthorn juice

由图3可知，随着超声时间的延长，SSC和三萜酸含量先显著增加后下降。超声提取具有空化、振动、粉碎和搅拌的功效，可以使细胞内容物快速溶出，与传统方法相比，极显著的缩短提取时间［22］。超声提取30 min、40 min，山楂汁中三萜酸和SSC含量达到最高值，分别为328.62 mg/100 g和5.42%。但随着时间的延长含量有所下降，可能由于超声波具有较强的机械剪切作用，长时间作用会使三萜酸物质分子结构被破坏。过长时间的超声作用不利于提高山楂汁中三萜酸物质的含量，且增加能耗，因此选择30 min为超声提取时间的最佳水平。

2.1.4超声功率对山楂汁三萜酸含量的影响

将山楂切片冷冻15h，匀浆、加酶后分别在60W、90 W、120 W、150 W功率下，50℃条件下超声30 min制备山楂汁。测定山楂汁SSC和三萜酸含量，结果如图4所示。

图4　超声功率对山楂汁可溶性固形物（A）及三萜酸（B）含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on soluble solid content（A）and tritepenoidic acid content（B）in hawthorn juice

由图4可知，山楂汁中三萜酸含量随着超声功率的增大而增加，在仪器最大功率150 W时山楂汁中三萜酸含量和SSC达到最高，分别为327.65 mg/100 g和5.22%。超声功率在超声提取过程中起着重要的作用［23］，适当的超声条件可以保持生物活性分子结构和特性。在一定范围内提高超声功率会增加山楂细胞的破碎程度，使山楂汁中三萜酸的溶出率升高。但是由于超声波的强机械作用，极端的增加超声波能量会破坏生物活性物质的分子链，造成活性物质分子的不正常降解，同时增加能耗［24-25］，因此将最佳超声功率确定为120 W。

2.2提取条件正交试验优化

综合以上单因素试验结果，利用正交试验考察冷冻时间、超声温度、超声时间、超声功率对山楂汁中三萜酸含量的影响，正交试验结果、方差分析分别见表1及表2。

通过表1中各个因素的k值和R值大小可知，4个因素对山楂汁中三萜酸含量的影响程度大小依次为超声功率（D）＞超声时间（C）＞冷冻时间（A）＞超声温度（B）。从表2方差分析结果可知，超声功率是影响山楂汁中三萜酸含量最重要的因素，对结果有显著影响（P＜0.05），超声时间对三萜酸的含量起次要作用（P＜0.1），其他2个因素中超声温度对结果影响最小，分析时用作误差列。在试验设计范围内，综合极差及方差分析结果，最终优化得到高三萜酸含量山楂汁超声制备的最佳工艺条件为A3B2C3D3，即冷冻20 h后，50℃温度下，功率150 W超声40 min。在该条件下进行3次验证试验制备山楂汁，测定其三萜酸含量平均值为（341.18±2.39）mg/100 g，SSC为（5.44±0.02）%。

表1　提取条件优化正交试验优化结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for extraction technology optimization

表2　正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experimental results

3　结论

通过单因素及正交试验优化得到制备高三萜酸含量山楂汁的最佳工艺条件为：冷冻时间20 h，超声温度50℃，超声时间40 min，超声功率150 W。在此条件提取的山楂汁中三萜酸含量为341.18 mg/100 g，SSC为5.44%。

冻融-超声辅助提取山楂汁，可以有效增加三萜酸类物质的溶出，缩短提取时间，降低能耗，是一种高效制备高品质山楂汁的技术方法。

［1］THOMAS F，THIERRY H，FRANCOISE M N.Phenolic profiles and antioxidative effects of hawthorn cell suspensions，fresh fruits，and medicinal dried parts［J］.Food Chem，2009，115（3）:897-903.

［2］LIU T X，GAO Y N，ZHAO M M.Extraction optimization，purification and antioxidant activity of procyanidins from hawthorn（C.pinnatifida Bge.var.major）fruits［J］.Food Chem，2010，119（4）:1656-1662.

［3］刘庆文.超声强化超临界CO2萃取山楂果中原花青素的研究［J］.食品研究与开发，2010，31（8）：234-236.

［4］LIN P Z，YANG B R，KALLIO K K.Characterization of phenolic compounds in Chinese hawthorn（Crataegus pinnatifidavar.major）fruit by high performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry［J］.Food Chem，2010，121（4）:1188-1197.

［5］尹利华，辛秀兰.山楂功能性成分提取及分析方法的研究进展［J］.食品研究与开发，2013，34（24）：297-300.

［6］王玲，吴军林，吴清平，等.山楂降血脂作用和机理研究进展［J］.食品科学，2015，36（15）：245-248.

［7］罗小凤，邹盛勤.南北山楂中5个三萜酸成分的比较研究［J］.食品科技，2015，40（5）：64-67.

［8］乔聚林，陈倩，朱传合.优化软化-酶法高黄酮山楂汁制备工艺研究［J］.中国食品学报，2011，11（1）：126-132.

［9］王彦杰，宋照军，孔瑾，等.山楂片浸提制汁新工艺研究［J］.河南科技学院学报：自然科学版，2008，36（3）：67-69.

［10］徐飞，钮福祥，张爱君，等.不同提取工艺对山楂汁质量的影响［J］.安徽农业科学，2006，34（11）：2512-2513.

［11］CHEMAT F，HUMA Z E，KHAN M K.Application of ultrasound in food technology:Processing，preservation and extraction［J］.Ultrason Sonochem，2011，18（4）:813-835.

［12］CHENG L H，SOH C Y，LIEW S C，et al.Effects of sonication and carbonation on guava juice quality［J］.Food Chem，2007，104（4）:1396-1401.

［13］TIWARI B K，O'DONNELL C P，CULLEN P J.Effect of sonication on retention of anthocyanins in blackberry juice［J］.J Food Eng，2009，93（2）:166-171.

［14］刘成莲.超临界流体萃取与超声技术在农产品加工中的应用［J］.农产品加工·学刊，2008（12）：32-33.

［15］BHAT R，KAMARUDDIN N，LIONG M T，et al.Sonication improves kasturi lime（Citrus microcarpa）juice quality［J］.Ultrason Sonochem，2011，18（6）:1295-1300.

［16］陈学红，秦卫东，马利华，等.不同制汁工艺对绿芦笋汁理化成分和抗氧化活性的影响［J］.食品工业科技，2012，33（13）：224-227.

［17］袁怀波，凌庆枝，马嫄.大孔树脂分离纯化山楂中总三萜酸的研究［J］.食品科学，2008，29（2）：155-157.

［18］代守鑫，周颖，王成荣.山楂汁不同提取工艺的优化研究［J］.饮料工业，2011，14（6）：11-13.

［19］吴映明，陈爱葵，彭锦红，等.超声波-超低温冻融处理对灵芝孢子粉多糖提取的影响［J］.中国食用菌，2008，27（3）：34-35.

［20］陈公德，何日柳，陈杰，等.生物酶法提取苦楝素工艺过程的研究［J］.应用化工，2010，39（1）：8-10.

［21］周连文，张存兰，刘新华.酶辅助超声波提取何首乌多糖及其抗氧化性研究［J］.食品科技，2008，33（1）：170-173.

［22］廖维良，赵美顺，杨红.超声波辅助提取技术研究进展［J］.广东药学院学报，2012，28（3）：47-50.

［23］马亚琴，叶兴乾，吴厚玖，等.超声波辅助提取植物活性成分的研究进展［J］.食品科学，2010，31（21）：459-463.

［24］张吉祥，欧来良.正交试验法优化超声提取枣核总黄酮［J］.食品科学，2012，33（4）：18-21.

［25］HROMÁDKOVÁ Z，ALFÖDI J，EBRINGEROVÁ A.Study of the classical and ultrasound-assisted extraction of the corn cobxylan［J］.Ind Crops Prod，1999，9（2）:101-109.

Extraction optimization of hawthorn juice with high tritepenoidic acids content assisted by freeze-thawing and ultrasonic technique

LIU Hui，ZHANG Chunling，CHEN Dalei，LV Zhenzhen，YANG Wenbo，JIAO Zhonggao*
（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Science，Zhengzhou 450009，China）

In order to optimize the processing condition of increasing tritepenoidic acids content in hawthorn juice，the effects of 4 factors including freezingtime，ultrasonic temperature，ultrasonic extraction time and ultrasonic power were investigated.The optimal extracting conditions for hawthorn juice with high tritepenoidic acid content were as follows:freezing time 20 h，ultrasonic temperature 50℃，ultrasonic extraction time 40 min and ultrasonic power 150 W.The content of tritepenoidic acids in hawthorn juice under these conditions was 341.18 mg/100 g.Freeze-thawing with ultrasonic technique was an efficient method for extracting hawthorn juice with high content of tritepenoidic acids.

hawthorn juice；tritepenoidic acids；ultrasonic extract；freeze-thawing

TS255.44

A

0254-5071（2015）10-0091-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.020

2015-09-09

中国农业科学院科技创新工程专项经费项目（CAAS-ASTIP-2015-ZFRI）；河南省科技攻关项目（152102110111）

刘慧（1984-），女，助理研究员，硕士，研究方向为果品化学与营养。

焦中高（1972-），男，副研究员，博士，研究方向为果品加工与贮藏。