一株转化阿魏酸产香兰素菌株的筛选与鉴定

严晓娟，宋勇强*，牛　犇，胡先望

（甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州730010）

一株转化阿魏酸产香兰素菌株的筛选与鉴定

严晓娟，宋勇强*，牛犇，胡先望

（甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州730010）

采用梯度稀释平板分离法从土壤中分离菌种，并通过与研究中心实验室购买和保存的其他11株菌株进行比较，最终筛选出了一株香兰素摩尔转化率和转化效率相对较高的菌株B7，结合菌株形态学特征、生理生化试验结果和菌株16S rRNA序列分析鉴定及系统发育分析结果，最终鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

阿魏酸；香兰素；筛选；鉴定

香兰素（vanillin）又名香草醛、香草素、香兰醛或香茅醛、甲基原儿茶醛、凡尼林［1］。化学名称4-羟基-3-甲氧基苯甲醛。香兰素具有香荚兰豆的香气，白色至黄色针状或粉末状结晶，微溶于水（1 g/100 mL，20℃），易溶于乙醇、苯甲基苯甲酸酯、冰醋酸、二硫化碳、吡啶、脂肪和芳香酯等有机溶剂和强碱溶液中。易受光化作用的影响，在空气中逐渐氧化。香兰素具有较低的气味识别阈值，在生产和储存过程中容易携带其他气味［2-3］。无毒、对人和动物无害，对皮肤和黏膜有局部的刺激［4］。香兰素是一种具有代表性的广谱香料，有“香料之王”的美称，也是重要的有机化学品中间体，在食品工业、医药工业、日化工业、烟草工业、电镀工业等领域得到了广泛的应用［5］。

香兰素是目前世界上产量最大的合成香料，需求量逐年递增。目前，市场上供应的香兰素有三种来源，即：（1）从香子兰花荚中提取的天然香兰素；（2）用化学合成法（如愈创木酚法、木质素法、黄樟素法等）生产的香兰素［6-8］；（3）用微生物法生产的香兰素［9-11］。化学方法生产香兰素产率高，处于香兰素合成主导地位。但是大多数化学合成的香兰素在纯度、香气、安全性等方面都低于天然提取的香兰素，并且化学工艺产生的废弃物污染环境。微生物转化法生产天然香兰素，在生产过程中转化率较高，生产成本较低，清洁环保，产品安全［12］。随着现代生物学的发展，微生物转化法生产天然香兰素逐渐成为研究焦点［13-14］。

目前，能够利用阿魏酸为底物生产香兰素的菌株有枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、链霉菌（Streptomycetaceae）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、拟无枝酸菌（Amycolatopsis）、食醋丛毛单胞菌（Pseudomonas acidovrans）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）等，其中拟无枝酸菌（Amycolatopsis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）能够将底物阿魏酸转化生成较高产量的香兰素［15］。为降低生产成本，近些年，采用基因工程手段或诱变育种选育高产菌株可以降低生产成本，提高转化率。

本研究从化妆品厂排污口处深层土壤中筛选分离出了5株可以转化阿魏酸产生产香兰素的菌株，通过初筛、复筛并和实验室其他购买和保藏的供试菌株进行对比之后，得到一株转化阿魏酸产香兰素效率较高且高产香兰素的菌株B7，通过形态学、生理生化试验及16S rRNA序列方法对所获得菌株进行鉴定，为工业化生物法合成香兰素提供新的菌种资源。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

分离样品取自甘肃省某化妆品厂排污口处深层土壤；部分试验菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC）、中国农业微生物菌种保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，ACCC）、广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心（Guangdong institute of microbiology ofmicrobialculturecollectioncenter，GIM）、甘肃省商业科技研究所（Gansu Institute of Business and Technology，GIBT）保藏的菌株。

1.1.2培养基

平板分离培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，1.0 g/L阿魏酸，琼脂20 g/L，pH 7.0。

富集培养基：15 g/L淀粉，0.3 g/L氯化钠，0.5 g/L硝酸钾，0.01 g/L七水硫酸亚铁，0.3 g/L磷酸氢二钾，0.3 g/L七水硫酸镁。

纯化培养基：20g/L琼脂粉，15g/L淀粉，0.3g/L氯化钠，0.5 g/L硝酸钾，0.01 g/L七水硫酸亚铁，0.3 g/L磷酸氢二钾，0.3 g/L七水硫酸镁。

初筛培养基：1 g/L阿魏酸，蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH 7.0。

种子培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH 7.0。

梯度诱导驯化培养基：配制阿魏酸质量浓度分别为0.2 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.6 g/L、2.0 g/L的种子培养基。

营养肉汁培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂20.0 g/L，自然pH，将马铃薯洗净去皮，切片后称取200.0 g，加水煮沸30 min，用纱布过滤后，加入葡萄糖和琼脂补足至1.0 L。充分加热溶解分装，121℃灭菌20 min。

1.1.3试剂

无水葡萄糖：天津市致远化学试剂有限公司；酵母膏：北京双旋微生物培养基制品厂；牛肉膏、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂；氯化钠：南京化学试剂有限公司；硫酸镁：成都化学试剂厂；磷酸氢二钾：西安化学试剂厂；阿魏酸：2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）：上海中秦化学试剂有限公司；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；琼脂粉：北京索莱宝科技有限公司；香兰素：天津市天新精细化工开发中心；以上试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

Mettler ToledoAL204分析天平：瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；LDZM型立式智能压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；HWS-150型恒温恒湿培养箱、DZG-6050型真空干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器：江苏常州市国立试验设备研究所；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台：苏州安泰空气技术有限公司；UV-1800PC紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；GL-21M湘仪离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机有限公司；PHS-3C型酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司；Eppendorf移液枪：德国艾本德股份公司；THZ-82N台式恒温振荡器培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；2720 Thermal CyclerPCR仪：美国ABI公司；DYY-5型稳压电泳仪：北京六一仪器厂；FR980凝胶成像仪：上海复日科技仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1产香兰素菌种的分离

称取10 g土壤置于250 mL三角瓶中，加入90 mL无菌水，摇匀。取混合后溶液的上清液，梯度稀释获得最终浓度分别为10-4g/mL、10-5g/mL、10-6g/mL、10-7g/mL的菌悬液。从中任意选取3个稀释度，用无菌移液枪准确吸取1 mL梯度稀释液于干净无菌的培养皿中，并且每一个稀释梯度做2个平行，然后将温度冷却至45℃左右的平板分离培养基溶液倒入无菌培养皿中，每个培养皿倒入12～15 mL，摇匀，待培养皿中的琼脂培养基凝固后，在恒温恒湿培养箱中30℃倒置培养48 h。

1.3.2香兰素的定性［16-18］

香兰素的定性检测采用薄层色谱法：将待测菌株发酵液、香兰素标准溶液、阿魏酸标准溶液分别用管口平整的毛细管滴加于薄层板一端约1 cm处的起点线上，置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5 cm，待展开剂前沿离原点约8cm处时，将色谱板取出，干燥后在波长254 nm的紫外照射灯下观察荧光条带。薄层层析展开剂为乙酸乙酯∶乙醇∶二氯甲烷∶水（2.0∶3.5∶3.5∶1.0，V/V）。若展开的发酵液条带中出现和香兰素标准液条带上紫色荧光点位置相同（即具有相同比移值Rf）的荧光点，则说明该菌株能够转化阿魏酸产生香兰素。

1.3.3菌种初筛

将平板分离得到的菌株分别接种到初筛培养基中，置于恒温振荡器上150 r/min、30℃振荡培养24 h后，取各菌株发酵液，采用1.3.2中香兰素定性方法并根据薄层色谱试验结果淘汰部分不转化阿魏酸产香兰素的菌株。

1.3.4香兰素标准曲线的制作

20∶1盐酸溶液（V/V）配制：精确量取浓盐酸10.0 mL，加入去离子水200 mL，混匀后备用。

0.5%的2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液：准确称取2-硫代巴比妥酸0.5 g，加入少量无水乙醇溶解，转移至100 mL容量瓶定容。

香兰素标准曲线的制作：精确称取香兰素0.02 g，用蒸馏水溶解，转移至100 mL容量瓶中定容作为母液。将母液稀释配制成20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200 mg/L梯度浓度香兰素溶液。取11支25 mL比色管，按表2混合溶液，待定容后，振荡摇匀，于55℃水浴保温10 min。然后于室温放置20 min，在波长440 nm处测定吸光度值，绘制香兰素标准曲线。

1.3.5菌种复筛

将经过初筛得到的各菌种活化后分别接种于种子培养基中，置于恒温振荡器上150r/min、30℃培养24h后，再加入10mL底物质量浓度为1g/L的阿魏酸溶液继续培养24h。培养结束后，测定各菌株发酵液中的香兰素含量（mg/L），通过比较其发酵液中的香兰素含量的高低进行复筛。

1.3.6供试菌株

其他供试菌株为在各菌种保藏机构所购买及本研究实验室保藏菌种见表1。

表1　用于筛选试验的保藏菌种信息Table 1 The information of preserved strains for screening tests

1.3.7菌株转化香兰素能力测定

取试管加入5mL20∶1（V/V）的盐酸溶液、2mL质量分数为0.5%的2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液、1mL发酵液，2mL蒸馏水。摇匀，于55℃水浴保温10 min，立即使用冷却水冲洗管外壁终止反应，室温放置20min，在波长440nm处测定吸光度值，以加入阿魏酸不含菌液的液体培养基作为参比，测定吸光度值。按照香兰素标准曲线回归方程计算发酵液中香兰素含量，香兰素摩尔转化率和转化效率的计算公式如下：

1.3.8生长量的测定

以加入阿魏酸不含菌液的液体培养基作为参比，在波长660 nm处测定菌株发酵液的吸光度值。

1.3.9形态及生理生化鉴定

将分离筛选得到的转化阿魏酸产香兰素的菌株依据东秀珠等主编的《常见细菌系统鉴定手册》［19］和《伯杰细菌鉴定手册（第八版）》［20］进行初步鉴定。

1.3.10菌株16S RNA序列鉴定及系统发育树构建［21］

挑取纯化后的菌株B7的单菌落接种于装有10 mL发酵培养基的三角瓶中，放入恒温振荡培养箱中，在温度30℃、转速150r/min的条件下振荡培养24h。用移液枪准确的吸取2 mL菌液，在低温高速冷冻离心机中以12 000 r/min离心2 min后，去除上清液，再按照生工SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书的试验步骤提取菌株的基因组DNA，作为模板。

首先进行16SrDNA的扩增，采用引物（上游：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；下游：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'），建立聚合酶链反应（polymerse chain reaction，PCR）体系（25 μL）：上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；Template（基因组）1 μL；脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）0.5 μL；Taq（5 U/μL）0.2 μL；10×反应缓冲液2.5 μL；最后加水补充至25 μL。

设定PCR程序：在94℃预变性5 min后进入循环程序：94℃变性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，共计35个循环，最后在72℃保温8 min。

精密吸取50 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，纯化以后进行后续DNA的测序工作，将提取的基因组DNA委托上海生工生物工程有限公司进行16S rDNA基因扩增序列测序。在GenBank数据库中提交测序结果，通过BLAST程序提交得到的16S rRNA序列，最后在美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）在线数据库中进行同源序列检索。将目标菌株的16S rDNA和在BLAST程序中检索到的与之有较高同源性的模式菌株的16SrDNA作最大同源性比较分析，并利用系统发育软件MEGA 4.0采用邻位相邻法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，同时进行重复次数为1 000次的Bootstrap测试，最终确定目标菌株的分类地位。

2　结果与分析

2.1香兰素含量标准曲线

以香兰素含量（x，mg/L）为横坐标、OD440nm（y）为纵坐标绘制香兰素标准曲线，结果见图1。

图1　香兰素标准曲线Fig.1 Standard curve of vanillin

由图1可知，标准曲线回归方程为y=0.001 1x-0.000 2，相关系数R2=0.998 7。表明香兰素含量与吸光度值呈良好的线性关系。

2.2菌种筛选结果

本实验通过初筛在土壤中得到14株菌落B3～B16，并通过添加底物阿魏酸发酵进行复筛，从中筛选纯化出5株能够转化阿魏酸生产香兰素的菌株B5、B7、B11、B14、B15，比较其摩尔转化率，结果如图2所示。

图2　五株菌株香兰素转化能力比较Fig.2 The comparison of conversion capability of vanillin among five strains

由图2可知，菌株B5、B11、B15的摩尔转化率均＜10%，只有菌株B7和B14的摩尔转化率＞10%，且菌株B7的摩尔转化率最高，达到了29.01%。从转化效率的结果看，菌株B7（49.66%）和B14（32.3%）的转化效率均高于其余3株菌株，菌株B7的转化效率是5株菌株中最高的，所以选取B7作为供试菌株进行后续试验研究。

2.3不同菌种转化阿魏酸产香兰素能力的比较

将筛选得到的菌株B7和研究中心实验室购买和保藏的其他11株菌种分别接种于种子培养基中，置于恒温振荡器上150 r/min、30℃培养24 h后，加入10 mL底物质量浓度为1 g/L的阿魏酸溶液继续培养24 h。发酵结束后，对各菌株转化阿魏酸产香兰素的能力进行测定和比较，并计算出各自的香兰素摩尔转化率和转化效率，结果见表2。

表212　株菌株香兰素转化能力的比较Table 2 Comparison of conversion ability of ferulic acid by twelve strains

由表2可知，从香兰素的产量看，细菌转化阿魏酸产生的香兰素质量浓度均高于真菌（酵母菌、丝状真菌），其中B7和阴沟肠杆菌E1所产生的香兰素质量浓度最高，而丝状真菌中除了黑曲霉A1以外，杯珊瑚菌C2、美味牛肝菌B2和鸡油菌C3所产生的香兰素质量浓度均较低；从摩尔转化率分析，除B7、黑曲霉和阴沟肠杆菌外，其他菌株的摩尔转化率均＜10%；从转化效率看，细菌的转化效率均高于真菌的转化效率，其中B7、黑曲霉、嗜热脂肪芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌的转化效率高于其他菌株，而B7的转化效率是所有12株菌株中最高的。因此，通过筛选和比较，最终确定B7为目标菌株，进行后续试验并对其进行纯化、鉴定及保藏。

2.4香兰素定性试验结果

用毛细管分别吸取香兰素和阿魏酸的标准液以及发酵液于制备好的GF254薄板上，放置点好样的薄层板于装有展开剂的展缸内进行层析，层析后取出挥干，在紫外检出器下观察蓝紫色斑点。取天然香兰素标准样品、阿魏酸标准样品、发酵后的发酵液进行薄层试验，得到菌株B7的薄层层析色谱图见图3。

图3　薄层层析结果Fig.3 Results of thin layer chromatography

薄层层析法可用于定性测定并指示反应的进程，在展开剂为乙酸乙酯∶乙醇∶二氯甲烷∶水（2.0∶3.5∶3.5∶1.0，V/V）的层析体系中，发酵液中的阿魏酸和香兰素都能够得到很好地分离。由图3可知，经过测量和计算，Rf香兰素=0.86；Rf阿魏酸= 0.62。观察到在发酵液的条带上，有两个荧光点，一个为深紫色，与旁边香兰素标准溶液条带上出现的荧光点颜色和位置都一致（即具有相同的Rf值），则说明该发酵液中有香兰素生成。

2.5菌株鉴定

2.5.1B7菌株形态

菌株B7革兰氏染色呈阳性，其显微镜下的镜检菌株形态见图4，菌落形态见图5。由图4可知，菌体形态为长杆状，以成对或链状排列，菌体的大小为（0.8～1.2）×（2.0～3.8）μm，形成芽孢，芽孢中生或近中生，孢子囊不膨大。

图4　菌株B7的镜检形态Fig.4 The micrograph of strain B7

由图5可知，在平板培养基上生长的菌株B7的菌落呈白色或微黄色，单个菌落近似圆形，边缘较整齐，半透明，菌落表面光滑湿润。

图5　B7的平板培养菌落形态Fig.5 Colonial morphology of strain B7

2.5.2生理生化试验结果

表3　菌株B7的生理生化特征Table 3 The physiological and biochemical characteristics of strain B7

由表3可知，菌株B7芽孢染色和革兰氏染色均呈阳性；5%的过氧化氢溶液的载玻片上，观察有大量的气泡产生，反应呈阳性；将B7分别于葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养基上穿刺培养，观察结果显示乳糖培养基仍为蓝色，而葡萄糖和蔗糖培养基变为黄色，说明该菌株可以利用葡萄糖和蔗糖，但不能利用乳糖；将B7接种于水解淀粉试验培养基上培养24 h后，向固体平板培养基表面滴加卢哥氏碘液，使碘液铺满平板，平板呈蓝色，说明该菌可以水解淀粉；在V-P试验中，B7接种培养后，培养基变为蓝色，说明该菌可以利用柠檬酸盐；菌株其他生理生化试验结果见表3。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，参考对照《常见细菌系统鉴定手册》分类系统中的描述，初步鉴定B7为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.5.3菌株16S rRNA基因序列鉴定及构建系统发育树

PCR产物经琼脂糖电泳检测，结果见图6。由图6可知，其PCR产物为一个大小约为1 400 bp的特异性片段，菌株B7的16S rRNA全长序列大小为1 437 bp。之后在NCBI在线数据库中进行序列比对的过程中发现，其与Bacillus属中编号为DQ923483.1的菌株Bacillus subtilis的同源性达到99.7%，然后借助构建系统发育MEGA 4.0软件生成直观清晰的系统发育树，结果见图7。

图6　菌株B7的PCR产物电泳图谱Fig.6 The electrophoresis pattern of PCR products of strain B7

图7　菌株B7的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree of strain B7

由图7可知，菌株B7与Bacillus subtilis（DQ923483.1）处在同一个分支上，通过1 000次bootstrap测试分析支持该分支；并且在GenBank数据库比对过程中发现，菌株B7与模式菌株Bacillus subtilis（DQ923483.1）的16S rRNA基因序列相似度为99.7%，由此推断菌株B7为Bacillus属中的Bacillus subtilis。

综上所述，结合菌株形态学特征、生理生化试验结果和菌株16S rRNA序列分析鉴定及系统发育分析结果，最终将菌株B7鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

3　结论

本研究从化妆品厂排污口处深层土壤中筛选能够转化阿魏酸产香兰素的菌株，从中筛选到14株菌株，其中5株具有转化阿魏酸产香兰素的能力，并通过与研究中心实验室购买和保存的其他11株菌株进行比较，最终筛选出了一株香兰素摩尔转化率和转化效率相对较高的菌株B7，结合菌株形态学特征、生理生化试验结果和菌株16S rRNA序列分析鉴定及系统发育分析结果，最终鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

高产菌株以阿魏酸为底物生物法合成香兰素的生产工艺潜力巨大，利用麦麸、谷糠等价格低廉的农副产品得到的阿魏酸转化香兰素，不但转化速率快，而且可以降低生产成本，提高农副产品的利用率。随着生物技术的进一步发展，一旦微生物发酵生产香兰素实现工业化，必将推动香兰素产业跨上一个新台阶。

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Screening and identification of a strain transforming ferulic acid to vanillin

YAN Xiaojuan，SONG Yongqiang*，NIU Ben，HU Xianwang
（Gansu Institute of Business and Technology，Lanzhou 730010，China）

The bacteria were isolated from soil by gradient dilution plate separation method.In final，a strain B7 with relatively high conversion capability of vanillin was screened by comparing with other 11 strains purchased and preserved in laboratory of research center.Through strain morphological characteristics，physiological and biochemical test results，16S rRNA sequence identification and phylogenetic analysis results，the strain B7 was inditified asBacillus subtilis.

ferulic acid；vanillin；screening；identification

TS252.54

A

0254-5071（2015）10-0047-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.011

2015-09-12

甘肃省食品酶制剂共性关键技术研究创新团队（098TTCA013）；甘肃省技术研究与开发专项计划（1205TCYA034）；甘肃省重点实验室建设计划项目（1309RTSA025）

严晓娟（1983-），女，工程师，硕士，研究方向为应用微生物。

宋勇强（1988-），男，工程师，硕士，研究方向为食品微生物学与发酵工程。