5种酚类物质对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的急性毒性

戴欣，常静，李济彤，杨淞霖，李建中,王会利

中国科学院生态环境研究中心 中国科学院环境生物技术重点实验室，北京 100085

5种酚类物质对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的急性毒性

戴欣，常静，李济彤，杨淞霖，李建中,王会利

中国科学院生态环境研究中心 中国科学院环境生物技术重点实验室，北京 100085

酚类物质作为一类主要的污染物，已引起国内外高度重视，但目前其对陆生生物的毒性研究较少。本试验探究了4-叔丁基苯酚、间甲酚、2-氯苯酚、2-甲酚、2,4-二氯苯酚这5种酚类物质对中国本土物种中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的急性毒性。在中国白羽鹌鹑的急性经口试验中，2-氯苯酚、2-甲酚的7 d的半致死浓度(7 d-LC50)分别为331 mg·kg-1和413 mg·kg-1，其他3种酚类物质的7 d-LC50均大于限度值1 000 mg·kg-1；在中国白羽鹌鹑的急性饲喂试验中，5种酚类物质的8 d-LC50均大于限度值 2 000 mg·kg-1；在中华蜜蜂的急性经口试验中，2-氯苯酚、2-甲酚和2,4-二氯苯酚的48 h-LC50分别为306 mg·L-1、358 mg·L-1和364 mg·L-1；在中华蜜蜂的急性接触试验中，2,4-二氯苯酚的48 h的半致死量(48 h-LD50)为2.6 μg·蜂-1，其他4种酚类物质的48 h-LD50均大于限度值100 μg·蜂-1。研究结果表明不同的酚类物质由于其结构不同亦表现出不同的毒性，甲酚的邻位取代比间位取代对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的毒性更高，不同物种表现出了相似的规律性。5种酚类物质对我国本土物种中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂毒性比对其他水生生物更敏感，存在良好的剂量效应关系。

酚类物质；中国白羽鹌鹑；中华蜜蜂；急性毒性

酚类化合物是指芳香环与羟基相连的一大类有机化合物，是美国国家环境保护局(U.S. EPA)列出的129种优先控制污染物之一[1],同时多种酚类污染物也被列入中国水中优先控制污染物黑名单[2]。酚类化合物是重要的化工原料，其应用非常广泛。环境中酚污染主要来自焦化厂、炼油、木材防腐、绝缘材料的制造、制药、造纸以及酚类化工厂的废水、废气等。

酚类化合物可通过大气沉降、污水灌溉和土壤吸附等途径，进入土壤环境。由于炼油厂等的污水排放或者固体废物的堆放，会造成炼油厂或炼油厂退役场地附近土壤受到酚类物质的污染[3]。随着含酚废水排入排污河，排污河沿线的土壤也会受到酚类物质的污染[4]。同样，污水灌溉或者农药的施用，均会使农田土壤受到酚类物质的污染[5]。然而，目前人们普遍关注的是酚类物质对水生环境的影响，而酚类物质对陆生生物的影响却少有研究[6-7]。

经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)关于化学品风险评价的指导准则中，蜜蜂[8-9]和鸟类[10-12]作为陆生生物的代表物种，是重要的陆生模式生物。鸟类是脊椎动物的第二大类群，在害虫防治等方面，发挥着重要的生态功能，也是衡量生态平衡的重要标志。蜜蜂是另外一种重要的非靶标生物，是自然界数量最多的传粉昆虫。然而，相较于水生生物，酚类物质对鸟类和蜜蜂的毒性研究还相对较少。目前国际上主要以日本鹌鹑和意大利工蜂作为鸟类和蜜蜂的通用模式物种。然而，因不同国家和地区在生物区系、自然环境等方面差别较大，本地物种与通用种对同种化学品的敏感性可能存在差异。选择适当的本土物种并将其应用于化学品的环境风险评价对维护生态系统稳定、保持本国的生物多样性具有重要意义。中国白羽鹌鹑是我国自行培育的、目前饲养的主要鹌鹑品种，中华蜜蜂则是我国独有的蜜蜂品种，属于东方蜜蜂(Apis cerana)的中国亚种。因此我们选用这2种本土物种作为受试生物，对5种酚类物质的急性毒性效应进行了研究,探讨将中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂等本土物种引入化学品环境风险评价中的重要性以及可行性。

1　材料与方法 (Materials and methods)

1.1试验材料

1.1.1试验生物

中国白羽鹌鹑(Chinese recessive white feather quail)由实验室自行饲养与繁育。中华蜜蜂(Apis cerana cerana)成年工蜂由北京市密云县中华蜜蜂谷提供，经实验室自行饲养与繁育。

1.1.2供试药剂

4-叔丁基苯酚、间甲酚、2-氯苯酚、2-甲酚、2,4-二氯苯酚，均为分析纯，购自国药集团化学有限公司。

1.1.3试验器材

试验鹌鹑笼采用的金属网孔笼，规格为80 cm(长) × 50 cm(宽) × 50 cm(高)，并配备有盛装食物和水的容器。试验蜂笼规格为：14.4 cm(长) × 10.5 cm(宽) × 12.4 cm(高)，上下以纱网衬里的木质蜂笼，木板厚度为1 cm左右，纱网孔径为2.5 mm。

1.2试验方法

1.2.1中国白羽鹌鹑的实验室规模化饲养及驯化

中国白羽鹌鹑在14日龄之前温度维持在(35±3) ℃，湿度维持在50%～70%。14日龄后，温度每天降低1 ℃，最终保持在(25±2) ℃，湿度不变。对于10日龄之前的幼体鹌鹑的饮用水应为温水(温度约为室温)，24 h光暗比为20 h∶4 h，光照时间逐日递减1 h，直至达到自然光照水平。

在进入成熟期(40日龄)后，将中国白羽鹌鹑按雌雄比3∶1进行分笼饲养。每天收集鹌鹑卵，收集到一定数量的鹌鹑卵后便可放入孵化箱内进行孵化。鹌鹑卵的储存条件为：温度15 ℃～16 ℃，湿度55%～75%；鹌鹑卵的孵化条件为：温度37.5 ℃，湿度70%～75%，孵化时间约为14 d。

在进行试验前，饲养的中国白羽鹌鹑需转入试验用鹌鹑笼中进行驯化，驯化时长约为1周。在驯化期间，若死亡率小于5%，则可以选取健康情况和大小较为相近的鹌鹑进行试验。

1.2.2中华蜜蜂的实验室规模化饲养及驯化

将饲养中华蜜蜂的蜂箱置于实验室外搭建的敞口雨棚下，定期查看蜜蜂酿蜜情况，酌情给予一定的蔗糖水防止食物短缺。冬季天冷后，于蜂箱内添加隔温板，往蜂排上添加一定量蜂蜜水以备蜂群过冬，并于蜂箱上添加稻草保暖。

饲养后的蜂群在试验前需要转入到试验用蜂笼进行为1周的驯化，在驯化期间，没有出现明显死亡状况，且使用乐果标准品为参比试验时结果未出现明显波动时，再选取身体健康、大小一致的工蜂进行毒理试验。

1.2.3试验方法的建立

中国白羽鹌鹑急性经口毒性试验参照《化学农药安全评价实验准则》、EPA及OECD相关准则[13]。试验所用的鹌鹑应来自同一批次，约为40日龄，体重为(100±10) g，健康活泼。试验前一天停止喂食，仅供清水。室温在(25±2) ℃，光照采用自然光照。根据预试验设置5个剂量组，每组10只鹌鹑，雌雄各半，并设置空白对照组。供试鹌鹑以经口灌注法一次性给药1.0 mL·(100 g体重)-1，连续7 d观察记录鹌鹑的死亡情况以及中毒症状，求出LD50及95%置信限。

中国白羽鹌鹑急性饲喂毒性试验参照《化学农药安全评价试验准则》、EPA及OECD相关准则。试验所用的鹌鹑应来自同一批，约为40日龄，体重为(100±10) g，健康活泼。试验前一天停止喂食，仅供清水。室温在(25±2) ℃，光照采用自然光照。根据预试验设置5个剂量组，每组10只鹌鹑，雌雄各半，并设置空白对照组。用含不同浓度药剂的饲料饲喂鹌鹑5 d，从第6天开始，以不含被试物的正常饲料连续饲喂3 d，观察记录鹌鹑的死亡情况以及中毒症状，求出LC50及95%置信限。

中华蜜蜂急性经口毒性试验参照《化学农药安全评价实验准则》，采用的是“小烧杯法”[14]。试验在人工气候箱中进行，温度控制在(25±1) ℃，湿度控制在60%左右。根据预试验设置5个剂量组。每组20只蜜蜂，每个浓度设置3个重复，并设置空白对照。于试验开始后第24小时和第48小时检查各浓度组蜜蜂的死亡情况。求出48 h-LC50及95%置信限。

中华蜜蜂急性接触毒性试验参照《化学农药安全评价实验准则》及OECD相关准则。试验在人工气候箱中进行，温度控制在(25±1) ℃，湿度控制在60%左右。根据预试验设置5个剂量组。每组20只蜜蜂，每个浓度设置3个重复，并设置空白对照。将约1 μL的药剂点于蜜蜂的前胸背板处，于试验开始后第24小时和第48小时检查各浓度组蜜蜂的死亡情况。求出48 h-LD50及95%置信限。

1.2.4数据处理

使用SPSS数据处理软件，进行Probit线性回归分析，得到其回归方程、LD50或LC50，及其95%置信区间[15]，并记录其显著性值。

2　结果(Results)

5种酚类物质对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的急性毒性试验结果见表1。研究结果表明，在急性经口毒性试验中，2-氯苯酚和2-甲酚对中国白羽鹌鹑表现出了较为明显的毒性。在给药约3 min后，鹌鹑出现明显的羽毛竖立、萎靡等症状。而在高剂量时，鹌鹑羽毛竖立的同时，伴随着站立不稳的症状，随即出现有鹌鹑倒地，直至死亡。2-氯苯酚和2-甲酚对中国白羽鹌鹑的7 d-LD50分别331 mg·kg-1体重和413 mg·kg-1体重。参考《化学农药环境安全评价准则》中的毒性分级标准(以下毒级评价均参照此标准)，这2种酚类物质对中国白羽鹌鹑的急性经口毒性均属于中毒。2-氯苯酚、2-甲酚对中华蜜蜂的48 h-LC50分别为306 mg·L-1、358 mg·L-1，参照标准，这3种酚类物质对中华蜜蜂的急性经口毒性属于低毒。

2,4-二氯苯酚对中国白羽鹌鹑的7 d-LD50以及8 d-LC50分别超过限度值1 000 mg·kg-1体重和2 000 mg·kg-1饲料，参照标准，这2种酚类物质对中国白羽鹌鹑的急性毒性均为低毒。2,4-二氯苯酚对中华蜜蜂的48 h-LC50为364 mg·L-1，为低毒。而其对中华蜜蜂的48 h-LD50为2.6 μg·蜂-1，表现为中毒。

表1　5种酚类物质对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的急性毒性

4-叔丁基苯酚和间甲酚对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的急性毒性均为低毒。对于半致死浓度低于限度浓度的试验结果包括回归方程、LD50或LC50、95%置信区间和显著性值见表2。

3　讨论(Discussion)

根据以上试验结果，参考《化学农药环境安全评价准则》中的毒性分级标准，除2-氯苯酚、2-甲酚对中国白羽鹌鹑的急性经口毒性为中等毒性，以及2,4-二氯苯酚对中华蜜蜂的急性接触毒性为中等毒性外，其余的急性毒性试验结果均为低毒。

2-氯苯酚对黑头呆鱼的96 h-LC50>10 mg·L-1，属于低毒[16]，对月牙藻的半效应浓度(EC50)为20.55 mg·L-1，属于低毒[17]；2,4-二氯苯酚对黑头呆鱼的96 h-LC50为8.3 mg·L-1，属于中毒[17]，对月牙藻的EC50为4.2 mg·L-1，属于低毒[16]。可见，随着苯酚中氯取代的增加，其对黑头呆鱼以及月牙藻的毒性也增加。而对于中国白羽鹌鹑，2,4-二氯苯酚的急性经口毒性反而要低于2-氯苯酚。但在蜜蜂的急性接触毒性中，2,4-二氯苯酚的毒性明显要高于2-氯苯酚，LD50分别为2.6 μg·蜂-1以及大于100 μg·蜂-1。这可能是由于随着氯取代的增加，其脂溶性更强，从而更容易进入中华蜜蜂体内，造成更严重的毒害。同样，如果氯取代继续增加，其对大型溞的毒性也会出现显著增加。2,4-二氯苯酚对大型溞的48 h-LC50为2.48 mg·L-1，而2,4,5-三氯苯酚对大型溞的48 h-LC50为0.46 mg·L-1[18]。

对甲酚和对氯酚对食蚊鱼(Gambusia affinis)的96 h-EC50分别为33 mg·L-1和21 mg·L-1[19]，均为低毒。可见对位取代基为甲基或者氯时，对氯酚和对甲酚对食蚊鱼表现出了相似的毒性。2-氯苯酚对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的毒性与2-甲酚对它们的毒性较为接近，毒级均为中毒。

对微生物的毒性研究表明，对甲酚、邻甲酚和间甲酚对I型假单孢杆菌的毒性依次降低，而对于II型假单孢杆菌，邻甲酚毒性最高，间甲酚次之[20]。由此可以看出，甲酚的邻位取代比间位取代对假单孢杆菌的毒性更高。类似，我们发现邻甲酚(2-甲酚)对中国白羽鹌鹑的急性经口的毒性表现为中等毒性，而间甲酚的中国白羽鹌鹑的急性经口毒性的LD50则大于1 000 mg·kg-1体重，表现为低毒；邻甲酚对中华蜜蜂的急性经口毒性的LC50为358 mg·L-1，而间苯酚对中华蜜蜂的急性经口毒性的LC50则大于2 000 mg·L-1。可见，甲酚的邻位取代比间位取代对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的毒性更高。

这5种酚类物质对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的毒性与对其他水生生物的毒性表现出了相似的规律性。但是，中国白羽鹌鹑或中华蜜蜂对某些酚类物质可能比水生生物更敏感。

陆生生态系统中，鸟类和蜜蜂是重要的受试生物。在目前的化学品环境风险评价中，仍以日本鹌鹑，意大利工蜂作为鸟类和蜜蜂的代表物种。然而，由于本土物种与通用种在体型或者生理上的差别，可能会导致其对化学品的敏感性存在差异[21]。如果本土物种对化学品更敏感，那么我们应该考虑将其作为受试生物用于化学品风险评价。我们实验室通过对比5种农药对中华蜜蜂和意大利工蜂的急性毒性发现，中华蜜蜂对这5种农药更为敏感，更适于农药的毒理学评价[22]。也有研究表明，东方蜜蜂印度亚种与意大利工蜂对多种农药的敏感性表现出了较为明显的差异。而在印度，已将当地的东方蜜蜂印度亚种作为常用的试验动物[23]。关于其他模式生物的本土化也有相关研究[24]。

表2　3种酚类物质对中国白羽鹌鹑及中华蜜蜂的急性毒性及其95%置信区间

中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂是中国鸟类和蜜蜂中具有代表性的本土物种，均已实现实验室的规模化饲养，并且对上述5种酚类物质呈现出良好的剂量效应关系，因此，我们可以考虑将它们作为化学品环境风险评价的受试生物。化学品对本土物种的毒性效应长期受到忽视，毒性数据也较为缺乏。在以后的研究中，我们应该继续积累化学品对本土物种的毒性数据，并将本土物种作为化学品环境风险评价的受试生物，这对本土物种以及生态环境的保护具有重要意义。

通讯作者简介：王会利(1976—)，女，副研究员，主要研究方向为农药环境行为及环境毒理。

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◆

Acute Toxicities of Five Phenols to Chinese Recessive White Feather Quail andApisceranacerana

Dai Xin, Chang Jing, Li Jitong, Yang Songlin, Li Jianzhong, Wang Huili

CAS Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

20 November 2014accepted 3 March 2015

Phenols are a kind of wide-spread contaminants and their toxicity to terrestrial organisms are less known. Acute toxicity studies were conducted by using the Chinese native species, Chinese recessive white feather quail (CWQ) and Apis cerana cerana (ACC), to estimate the median lethal dose/median lethal concentration of phenols. The 7 d-LD50of oral toxicity experiment of 2-chlorophenol and o-cresol to CWQ were 331 mg·kg-1and 413 mg·kg-1, respectively. The 48 h-LC50of 2-chlorophenol, o-cresol and 2,4-dichlorophenol to ACC were 306 mg·L-1, 358 mg·L-1and 364 mg·L-1, respectively. The 48 h-LD50of 2,4-dichlorophenol to ACC was 2.6 μg·bee-1. The 2-chlorophenol and o-cresol are moderately toxic chemicals to CWQ in acute oral toxicity test, and 2,4-dichlorophenol is moderately toxic chemical to ACC in acute contact toxicity test. The other chemicals are low toxic chemical to CWQ and ACC. Further more, we discovered that the toxicity of phenols is related to their chemical structure. The toxicity of o-cresol is higher than m-cresol to CWQ and ACC. Similar situation was discovered for other organisms. CWQ and ACC are sensitive to these five phenols and significant dose-effect relationship were also discovered.

phenols; Chinese recessive white feather quail; Apis cerana cerana; acute toxicity.

科技部863计划资源环境领域重大项目(No．2012AA06A302)； 国家自然科学基金项目(No．21477152)

戴欣(1989-)，男，硕士，研究方向为生态毒理学，E-mail: xindai_st@rcees.ac.cn；

Corresponding author)， E-mail: huiliwang@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141120002

2014-11-20 录用日期：2015-03-03

1673-5897(2015)6-281-06

X171.5

A

戴欣, 常静, 李济彤, 等. 5种酚类物质对中国白羽鹌鹑和中华蜜蜂的急性毒性[J]. 生态毒理学报，2015, 10(6): 281-286

Dai X, Chang J, Li J T, et al. Acute toxicities of five phenols to Chinese recessive white feather quail and Apis cerana cerana [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 281-286 (in Chinese)