农用抗生素XBP-03-A的分离及结构鉴定

张 婷，周金燕，谭 红

（1. 山东职业学院生物工程系，山东 济南 250104；2. 中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041）

抗生素XBP-03-A 是从我国西部地区采集的土样中分离得到的链霉菌XBP-03 菌株所产生的次级代谢物质，在筛选中发现其产生的代谢物质对多种病原菌具有抗菌活性[1]。经对该抗生物质的分离纯化和鉴定分析，发现其中活性组分XBP-03-A 为谷氏菌素。本文报道抗生素XBP-03-A 的制备、分离、纯化及结构分析等工作，以期为分析链霉菌XBP-03 发酵液中的其他活性成分提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

链霉菌XBP-03 的发酵液由中国科学院成都生物研究所应用与环境微生物研究中心提供。抑菌测定指示菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus Ym1004），由中国科学院成都生物研究所应用与环境微生物研究中心提供。抑菌活性测定培养基：蛋白胨0.15%，磷酸氢二钠0.005%，牛肉膏0.15%，琼脂1.8%，pH 值7.8～8.0，培养基需经0.1 MPa，121℃灭菌30 m in。

仪器设备及试剂：YJ-875 型医用净化工作台、LRH-250A 型生化培养箱、BüCHI R-114 型旋转蒸发仪、GL-20G-Ⅱ型离心机、876-2 型真空干燥箱；玻璃层析柱；美国Perkin Elmer Lambda 35 型紫外可见分光光度计；SHIMADZU（岛津） 液相色谱仪系统；LC-10AT 型输液泵，SPD-10A 紫外检测器，7725i 进样阀；N3000 色谱工作站（浙江大学智能信息研究所）；HC-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，安捷伦公司）、Bouns-RP 柱（4.6 mm×250 mm，安捷伦公司）；GF-254层析板；培养皿；试管；试剂瓶等；超纯水（18.2 MΩ）、甲醇、丙酮、冰乙酸、正丁醇、乙醇（均为国产分析纯）、进口色谱纯甲醇、进口色谱纯乙腈、四环素（sigma 公司进口分装）、正相硅胶载体（青岛海洋化工）

1.2 试验方法

1.2.1 上柱样品的制备 链霉菌XBP-03 通过深层发酵培养50 h 后，发酵培养液以6 000 r/m in 的条件离心15 min，取上清液，备用，记为发酵液。此发酵液采用D101 大孔树脂进行动态脱色处理后[2]，再利用3 倍体积无水乙醇沉淀，取上清液。此上清液经旋转蒸发仪在45℃浓缩到少量体积，再用20 倍体积无水乙醇沉淀，收集沉淀，放在真空干燥箱里40℃干燥12 h，得到黄色粉末粗品。用少量水溶解此粗品后，按照粗品∶硅胶=1∶1.5（w/w）拌料，此物料为上柱样品。

1.2.2 硅胶柱层析分离 以乙醇-水作为流动相，柱层析硅胶（100～200 目）为固定相[3]，采用湿法装柱，使流速控制在2 m L/m in。利用梯度洗脱的方法，即乙醇∶水=8∶1、乙醇∶水=4∶1，每250 m L 收集一瓶，每一梯度洗5个柱体积，柱层析结果利用薄层层析方法检测分析，展层效果相近的洗脱液合并浓缩，各流份用管碟法进行活性跟踪检测，活性样品继续采用硅胶柱分离。

1.2.3 洗脱液检测 （1）生物活性跟踪:各流份用管碟法进行活性跟踪检测，使用管蝶法[4]分别测定其对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果。（2）TLC 检测：将生物检测得有抗细菌活性的洗脱液，于GF-254 层析板上点样，以乙醇-氨水-水为展开剂，采用紫外灯254 nm 照射和5%茚三酮丙酮溶液染色相结合的方法显色。检测后将斑点一致的收集液合并起来，减压浓缩后测抑菌活性，活性样品继续采用硅胶柱分离第二次，方法同1.2.2。

1.2.4 HPLC 制备XBP-03-A 经过上述步骤的分离纯化过程，能够得到单一组分含量较高的样品，还需使用高相液相色谱法（HPLC）法制备[5]两次，进一步达到核磁纯度，从而可以鉴定其结构。

HPLC 一次制备条件：Bouns-RP 柱，流动相乙腈-水（6∶4），流速0.5 m L/m in，检测波长265 nm，柱温40℃；HPLC 二次制备条件：HC-C18 柱，流动相甲醇-水（5∶95，含0.05%冰乙酸），流速0.5 m L/m in，检测波长265 nm，柱温40℃。

分别收集目标峰，利用HPLC 进行纯度分析后，旋转蒸发浓缩至干后，得到XBP-03-A 白色粉末，用此样品进行结构分析及活性检测。

1.2.5 XBP-03-A 的抑茵活性检测 制备时取少量在HPLC 图谱峰尖时流出的溶液，将其浓缩干燥后，用无菌水溶解，使用滤纸片法测其抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 硅胶层析结果

利用梯度洗脱硅胶柱层析的方法，每250 m L 收集一瓶，经薄层层析检测，将展层效果相近的洗脱液合并，相应地将发酵液粗提物分为8个流份，并对以上8个流份进行管碟法抑菌活性检验。结果显示，1 至6 流份无活性，7、8 流份具有抑菌活性（图1）。

图1 硅胶柱层析流份的活性

将有活性的7、8 流份再经过反复正相硅胶柱层析分离纯化，分别得到纯度较好，薄层层析为单一斑点的组分，用于进一步制备。

2.2 XBP-03-A 的HPLC 制备

2.1 中有活性的7、8 流份经过反复硅胶柱层析进行分离纯化，得到的纯度较好的组份，进一步通过高效液相色谱制备两次，得到XBP-03-A。XBP-03-A 的液相谱图如图2。

图2 XBP-03-A 的HPLC 图

2.3 XBP-03-A 的活性测定

活性测定结果表明，XBP-03-A 的抑菌活性较强（图3）。

图3 XBP-03-A 的抑菌活性

2.4 XBP-03-A 的结构鉴定

采用紫外光谱、质谱、核磁共振谱（13C-NMR 和1H-NMR）等分析方法对XBP-03-A 结构进行分析。

XBP-03-A 化合物的紫外特征谱图如图4，与典型的胞嘧啶碱基核苷类化合物的紫外特性一致[6]，其水溶液在265 nm 处有中等强度吸收峰，远紫外区存在最大吸收，其0.1 mol/L HCl 溶液吸收峰发生红移（向长波方向移动），且伴随摩尔吸光系数显著增加。

经HR-ESI-MS 分析测定，XBP-03-A 的分子离子峰为m/z 444.1817 [M+H]+，二倍分子离子峰为m/z 887.3601[2M+H]+，如图5，推测分子量为443。

13C -NMR（D2O）：δC171.8，171.7，167.0，166.1，157.8，141.7，97.2，83.2，75.9，73.5，71.3，61.3，59.7，55.7，53.4，33.0；1H-NMR（D2O）：δH7.74（d），6.05（d），5.67（d），4.49（s），4.12（m），4.03（m），3.87（m），3.80（m），3.78（m），2.69（s）。结合氢谱、碳谱及元素分析初步定出XBP-03-A 的分子式为C16H25N7O8。对照Dolak[7]和Murao[8]发表的数据，发现XBP-03-A 与两者文章中gougerotin 的C 和H化学位移值相近度很高，确定XBP-03-A 结构式与gougerotin[9]的结构式相同，结构见图6。

图4 XBP-03-A 的紫外特征

图5 XBP-03-A 的ESI-MS

图6 XBP-03-A 的化学结构

XBP-03-A 与gougerotin 的核磁波谱数据对比，结果见表1。

另外，在链霉菌XBP-03 发酵液中还分离到一种单体化合物，经鉴定其结构与胞嘧啶葡萄糖醛酸[10]相同，见图7。由于核苷肽类抗生素的生物合成机理具有相似性[11]，均先形成核苷，再经酶催化，在核苷上连接不同的氨基酸，最终形成不同的核苷肽抗生素。因此，推测胞嘧啶葡萄糖醛酸是谷氏菌素生物合成的中间体。

谷氏菌素是一种核苷肽类抗生素，分子构成包括3个部分，即胞嘧啶、氨基已糖和肌氨酞丝氨酸二肽，具有抗细菌、支原体及抗病毒和肿瘤等活性[12]。早期，Murao 等在一株链霉菌发酵液中发现一种植物生长抑制剂，命名为谷氏菌素。胡继兰等[13]从采自云南土样中分离的一株链霉菌发酵液中提取分离得到一个具有抗肿瘤活性的物质，命名为云谷霉素，经鉴别该物质与谷氏菌素相同。M igawa 等[14]采用固相合成法实现了谷氏菌素的全合成，进一步推动了谷氏菌素的应用。

表1 抗生素XBP-03-A 与谷氏菌素的13C 和1H化学位移数据对比

图7 胞嘧啶葡萄糖醛酸的化学结构

本文报道的从链霉菌XBP-03 发酵液中发现的抗菌物质XBP-03-A，结构与谷氏菌素相同，不仅为分离纯化链霉菌XBP-03 发酵液中的其他活性成分奠定了试验基础，而且为分离不解离的极性物质提供了思路。同时还分离得到了构成XBP-03-A 的结构单元胞嘧啶葡萄糖醛酸，可为研究链霉菌XBP-03 次级代谢产物的生物合成途径提供线索。

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