张阿娥庄培德
(1.福建省泉州市洛江区动物疫病预防控制中心 362011;2.福建省泉州市洛江区河市畜牧兽医站 362011)
雏番鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定
张阿娥1庄培德2
(1.福建省泉州市洛江区动物疫病预防控制中心 362011;2.福建省泉州市洛江区河市畜牧兽医站362011)
从洛江区临床发病鸭分离到2株病毒,2株分离病毒能够致死鸡胚,能被Ⅰ型鸭病毒性肝炎标准强毒高免血清特异性中和。分离毒株在鸡胚上传代培养,并测定ELD50分别为10-6.32/0.2m L、10-5.49/0.2m L;经动物回归试验,对1日龄雏番鸭的致死率分别为80%和70%,雏番鸭出现明显的角弓反张姿态,剖检可见肝脏出血斑、出血点,为鸭病毒性肝炎的典型症状,表明分离到的病毒为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)。
鸭病毒性肝炎分离鉴定
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒 (Duck Hepatitis Virus,DHV)引起的一种急性接触传染性疾病,主要侵害4周龄以内的雏鸭,特别是1周龄内的雏鸭最易感染,死亡率可达90%以上[1],是严重危害养鸭业的传染病之一。临床表现为痉挛,头向背部后仰,呈“角弓反张”,俗称“背脖病”,剖检症状见肝脏有血斑或出血点,以肝炎为主。1963年以来,上海、北京、山东和福建等地陆续报道有该病的发生,由Ⅰ型DHV所引起[2-5]。2014年6月,泉州市洛江区某2家番鸭养殖场2~15日龄雏番鸭发生疑似Ⅰ型鸭肝炎的疾病,发病雏番鸭表现为突然发病、角弓反张并很快死亡。为掌握发病原因,对病原进行了分离鉴定,现将结果报告如下。
1.1试验材料I型鸭肝炎病毒标准毒株购自中国兽药监察所;抗I型鸭病毒性肝炎病毒标准阳性血清由福建农林大学动科学院动物保健研究所惠赠;SPF鸡胚购自山东SPF种鸡场;雏番鸭购自莆田某鸭场1日龄非免疫雏番鸭。
1.2待检病料取自洛江区某2家番鸭养殖场1~ 14日龄死亡雏番鸭的肝脏,肝脏呈现肿大、出血点、出血斑的典型症状,临床诊断为疑似鸭病毒性肝炎病毒感染。命名为MJ株和HS株。
1.3病料处理无菌采取病死雏番鸭肝组织,剪碎后放入研钵中,加入PBS研磨后,加入双抗,将悬液4 000 r/min离心30min,取上清液,0.22μm滤器过滤,分装过滤液(病毒液)于-70℃保存备用。
1.4细菌分离无菌取病死雏鸭肝脏,接种于普通琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板,置37℃恒温箱和CO2培养箱48 h,观察细菌生长情况。
1.5鸡胚接种每次取0.2 mL病毒液接种10枚9日龄SPF鸡胚尿囊腔,每天照蛋观察3次,连续3~5 d,收获24 h后死亡鸡胚尿囊液和胚体,经普通琼脂培养基杂检,连续传代5次。
1.6分离毒株鸡胚半数致死量(ELD50)测定2个分离毒株第5代尿囊液分别作6个稀释度,即10-3~10-8,每个稀释度取0.2mL接种5枚鸡胚,置37℃孵化,每天观察记录结果,6 d后按Reed-Muench法计算ELD50。
1.7鸡胚中和试验取2个分离毒株第5代尿囊液稀释至200 ELD50,分别与I型DHV阳性血清等量混合,37℃水浴1 h,取0.2mL接种SPF鸡胚,同时设标准毒株、分离毒株、生理盐水作对照,每天照胚3次,观察6 d,记录死亡胚数。
1.8氯仿敏感性试验取2个分离毒株第5代尿囊液2mL,加入96μL氯仿,4℃振荡10min,5 000 r/min离心5min,吸取上层液,连续10倍稀释,取10-3-10-75个稀释度,每个稀释度0.2 mL接种鸡胚5枚,37℃孵化,每天照胚3次,记录死亡胚数,观察6 d,测ELD50。对照病毒液加入96 uL生理盐水,作同样的处理和滴定。氯仿处理病毒液的滴定比对照病毒液下降2个对数以上者,判为对氯仿敏感。
1.9动物回归试验选择无鸭病毒性肝炎母源抗体的1日龄雏番鸭40羽,分为4组。分别取2个分离毒株第5代尿囊液,按照0.2mL/羽攻毒剂量,采取腿部肌肉注射方式对第1组、第2组各10羽番鸭进行攻毒。第3组为标准强毒株对照,第4组为生理盐水对照,方法均同上。4组试验番鸭均隔离饲养,每天记录番鸭发病和死亡情况,并对死亡雏番鸭进行剖解。
2.1病毒分离病毒液接种鸡胚传代6次,从第2代开始,接种的鸡胚多数在60~120 h出现死亡。病毒液在鸡胚上传代4次后,鸡胚死亡多集中在48~72 h,死亡鸡胚发育不良,全身出血,肝脏有出血点或出血斑,收集该鸡胚病毒尿囊液,置-70℃保存备用。
2.2细菌分离死亡雏番鸭肝脏经普通琼脂、巧克力琼脂和麦糠凯琼脂平板培养,均无细菌生长。
2.3鸡胚中和试验2株分离毒株与I型DHV阳性血清等量混合后接种鸡胚,均未见鸡胚死亡,病毒标准毒株对照组鸡胚全部死亡,表明2个分离毒株均能被I型鸭病毒性肝炎阳性血清中和。
2.4分离毒株ELD50测定通过对分离毒株2次重复试验,按Reed-Muench法计算出分离株MJ5和HS5在鸡胚中的半数致死量分别为 10-6.32/0.2 mL、10-5.49/0.2mL。
2.5氯仿敏感试验2株分离毒株经氯仿处理后接种鸡胚,9枚鸡胚均死亡,与对照组结果没有差异。经氯仿处理后MJ5株、HS5株病毒的ELD50分别为10-5.34/0.2 mL、10-4.68/0.2 mL,对照组病毒的ELD50分别为10-6.3/0.2mL、10-5.49/0.2mL,表明2株分离毒株对氯仿不敏感、无囊膜。
2.6动物回归试验2株分离毒株分别接种感染1日龄雏番鸭,对雏番鸭的致死率分别为80%和70%(见表1),死亡时间多数集中在72 h以内,症状表现为短时间内停止运动,蹲伏并半闭眼、打盹、倒卧,两腿痉挛性后伸,头向后背,一般在出现症状后约1 h死亡,死亡雏番鸭呈“角弓反张”(见图1),剖检死亡雏番鸭,肝脏肿大、出血,表面有出血斑、出血点(见图2),上喙淤血,胆囊胆汁充盈,呈青褐色;有的可见肾脏出血点、脾脏坏死。
表1 动物回归试验情况
图1 死亡雏番鸭“角弓反张”
图2 死亡雏番鸭肝脏出血
1)1950年,Levine首次报道运用鸡胚中和试验开展DHV-I的诊断[6]。1969年,Hwang研究表明运用鸡胚中和试验开展DHV-I诊断,试验准确、重复性好。目前鸡胚中和试验仍然是公认的权威方法,因此,运用鸡胚中和试验,对洛江区域内分离的疑似鸭肝炎病毒株进行鉴定,但鸡胚中和试验存在操作程序多、费时的缺点,不适于快速诊断,对于快速、特异、操作方便并适用临床大量样品的检测,可参照Yang M等成功建立的RT-PCR检测方法进行[7]。
2)试验从疑似鸭病毒性肝炎的病死鸭病料中分离到2株病毒,该病毒能致死鸡胚,病毒能被Ⅰ型鸭肝炎病毒标准强毒高免血清特异性中和;病毒人工感染3日龄雏番鸭,在很大程度上复制出了DVH的流行特点,如发病急、病程短、病死率高,其临床症状及剖检病变与自然感染病例相同,结果表明洛江辖区内分离的2株病毒为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒。
3)试验表明,洛江辖区内番鸭养殖业存在鸭病毒性肝炎流行,若疫情被延误,对雏鸭的致死率可达90%,辖区、镇兽医部门和番鸭养殖场业主应高度重视,督促指导辖区内番鸭养殖业主落实防疫、消毒、自繁自养和全进全出等疫病防控措施,尤其是要把好免疫关,制定合理的免疫程序,应用疫苗进行预防接种,减少该病的发生,对于无母源抗体的雏番鸭,在l~3日龄采用饮水方式用鸭病毒性肝炎弱毒疫苗免疫1次,可有效防控雏鸭发病;对于种鸭,在开产前间隔15 d接种2次鸭病毒性肝炎疫苗,之后隔3~4个月加强免疫1次,可以保证雏鸭具有较高的母源抗体,获得较好的保护。
[1]卡尔尼克BW.禽病学[M].10版.高福,苏敬良,译.北京:中国农业出版社,1999.
[2]郭玉璞,潘文石.北京鸭病毒性肝炎血清型的初步鉴定[J].中国兽医杂志,1984,10(11):2-3.
[3]刘兆宇,程安.春雏鸭病毒性肝炎的研究进展[J].中国家禽,2002,10(24):6-9.
[4]王桂英,朱明霞,王岳.Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离与鉴定[J].动物医学进展,2009,30(10):66-68.
[5]王劭,朱小丽,程晓霞.鸭病毒性肝炎病毒分离鉴定及VP1基因序列分析[J].福建农业学报,2008,23(4):359-363.
[6]Levine.P P.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America[J].Cornell Veterinarian,1950,40(4):71-86.
[7]Yang M,Cheng A,W ang M,et a1.Development and application of a one-step real-time Taqman RT-PCR assay for detection of Duck hepatitis virus typel[J].Virol Methods,2008,53(I):55-60.
Isolation and analysis ofmuscovy duck hepatitis virus
Zhang Ae1Zhuang Peide2
(1.Animal disease prevention and control center of Luojiang county,Quanzhou 362011;2.Veterinary service center of Heshi,Luojiang county,Quanzhou 362011)
Two virus isolateswere isolated from dead ducks in Luojiang county.The iso1ated virus caused death of chicken embryos,and was specifically neutralized by anti-duck hepatitis virus type Ihyper immune serum.The isolateswere passed in chicken embryos and the titerswere 10-6.32ELD50/0.2mL to 10-5.49ELD50/0.2 mL.Typical clinical signs and pathological changes such as opisthotonos and hepatic hemorrhage were observed when the isolates were inoculated to muscovy ducklings,resulting in 80%to 70%mortality. The resu1ts confirmed that the isolated viruswere a duck hepatitis virus serotype I(DHV-I).
duck hepatitis virus iso1ation identification
A
1003-4331(2015)01-0008-03