快律宁胶囊对外源性自由基所致心律失常的影响△

于晓明，杨传华，陆峰

(1.江西中医药大学 附属医院，江西 南昌 330000；2.山东中医药大学 附属医院，山东 济南 250011)

·基础研究·

快律宁胶囊对外源性自由基所致心律失常的影响△

于晓明1*，杨传华2，陆峰2

(1.江西中医药大学 附属医院，江西 南昌 330000；2.山东中医药大学 附属医院，山东 济南 250011)

目的：研究快律宁胶囊(KLN)对外源性自由基所致心律失常的影响，对比研究KLN与维拉帕米对其的保护作用。方法：将SPF级SD大鼠分为对照组，维拉帕米组和KLN胶囊高、中、低剂量组，采用Langendoff灌流装置对大鼠离体心脏灌注硫酸亚铁/抗坏血酸的方法，复制外源性自由基所致大鼠心律失常模型，对比研究KLN胶囊与维拉帕米对其的保护作用。结果：与对照组相比，KLN胶囊可以剂量依赖地减少对外源性自由基所诱发室性早搏(VEB)、室速(VT)的发生次数(P<0.01)；KLN胶囊3个剂量组及维拉帕米组均未出现室颤(VF)，而对照组则诱发出VF，但差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，KLN胶囊高剂量组心律失常的出现时间较晚(P<0.05)，而KLN胶囊中低剂量组、维拉帕米组心律失常的出现也有推迟的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与对照组相比，KLN胶囊3个剂量组的心率明显减慢，而且呈剂量相关性；与对照组性比，KLN胶囊高、中剂量组的心律失常评分明显降低(P<0.05)，而KLN胶囊低剂量组和维拉帕米组则与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：KLN胶囊对外源性自由基诱发的心律失常可能具有预防和治疗作用，可以明显减慢心率，并可能对恶性心律失常(VT、VF)的发生具有一定的预防作用，其疗效优于维拉帕米。

快律宁；心律失常；外源性自由基；离体药效学

心血管疾病是一类威胁人类健康的疾病，其发病率和死亡率在各类疾病中占首位。而心律失常发生率在心血管疾病中排在首位，故心律失常的治疗就显得尤为重要。目前临床上所用的大多数抗心律失常药物在治疗心律失常的同时又具有致心律失常作用，或者可引起其他心血管疾病，这使该类药物的应用受到限制。因此开发研究新的抗心律失常药具有一定的临床意义。心律失常属于中医“心悸”的范畴，心阴虚火旺是快速型心律失常的重要病机之一，快律宁(以下简称为KLN)胶囊是在中医经典理论和治则治法指导下，通过杨传华教授多年的临证经验积累，在1994—1999年主持完成山东中医药大学附属医院立项课题“阴虚火旺型快速型心律失常的临床证治探讨”研究的前提下，逐步形成的山东中医药大学附属医院院内制剂。全方由生地、黄连、苦参、当归、酸枣仁、柏子仁组成，可以“清心火、养心阴、安心神”，适用于心阴虚火旺型的心律失常。本研究是在前期“快律宁”复方有效成分组筛选及安全性评价的基础上，应用KLN胶囊开展动物实验模型的离体药效学研究。采用Langendoff灌流装置对大鼠离体心脏灌注硫酸亚铁/抗坏血酸的方法，复制外源性自由基所致大鼠心律失常模型，对比研究KLN胶囊与维拉帕米对其的保护作用。

1 材料

1.1 主要设备和仪器

Langendorff 灌流装置：自制，蠕动泵，灌流管道系统，恒温水循环装置，超级恒温浴槽(SC-15宁波新芝生物科技股份有限公司)，水压测量计，电子天平(AB-17型号，瑞士METT LER TOLEDO，精度为0.000 1 g)、超净工作台、防震台，玻璃毛坯(上海实生细胞生物技术有限公司)；Intel P4，256 MB，40GB计算机。BL-420生物机能实验系统+通用放大器(成都泰盟科技有限公司)、常规手术器械、注射器。

1.2 主要试剂及其配制

戊巴比妥钠(分析纯，上海化学试剂采购站分装厂，批号：96-01-22)：配成3%溶液备用。

肝素钠(12 500 U/支，天津万邦生化医药有限公司，批号：1201115-a)：配成1%溶液备用。

盐酸普罗帕酮注射液(SIGMA公司，批号：110401)：加等容积注射用水稀释。

Krebs-Henseleit缓冲液(mmol·L-1)：NaCl 118，KCl 4.7，MgS04·7H20 1.2，KH2P041.2，NaHC0325.0，CaCl22.5，Glucose 11.0，pH 7.4，渗透压300 mOsm·L-1)。

KLN胶囊(江苏江阴药业有限公司，0.48 g/粒，批号：20110920)，以0.9%氯化钠溶液按设计分别稀释，调pH至7.40，0.45 μm微孔滤膜过滤，分装备用。

盐酸维拉帕米注射液(上海禾丰制药有限公司，批号：4E12002)：2 mL∶5 mg。

1.3 动物选择

健康成年SD大鼠(北京维通利华公司，SPF级)30只，雌雄各半，体重240～270 g，饲养于首都医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(京)2007·004。

2 方法

2.1 分组方法

按性别和体重，采用随机数字表法等分为5组(n=6)：对照组、KLN胶囊高剂量组、KLN胶囊中剂量组、KLN胶囊低剂量组、维拉帕米组。

2.2 Langendoff心脏灌流

用2%戊巴比妥钠0.2 mL·(100 g)-1和1%肝素钠0.5 mL·(100 g)-1同时对大鼠腹腔注射。动物麻醉后，取仰卧位固定，开胸，在距主动脉起始部3～4 mm处取下心脏，迅速放入预冷0 ℃灌流液中停跳，冲洗心腔和血管内的残留血液后，将心脏迅速移置到Langendoff灌流装置进行非循环不作功灌流，灌流压0.82 kPa。灌流液为Krebs-Henseleit缓冲液。灌流前以95%O2+5%CO2混合气平衡15 min，灌流中持续通气。在整个灌流过程中，用SC-15型超级恒温水浴器使灌流液保持在37 ℃，pH 7.4，冠脉压力用恒流泵控制在9.8 kPa(100 cmH2O)，灌流过程中，铂金电极的两极分别置于心脏表面的左上及右下角，记录II导联心电图。

2.3 分组灌流给药

对照组：离体心脏预灌15 min后，灌流液中加入硫酸亚铁(0.25 mmol·L-1)/抗坏血酸(1.0 mmol·L-1)持续灌注30 min，观察心电图变化。KLN胶囊的高、中、低剂量组：灌流液中分别加入药物3、1、0.3 g·L-1，预灌15 min后，灌流液中加入硫酸亚铁(0.25 mmol·L-1)/抗坏血酸(1.0 mmol·L-1)持续灌注30 min，观察心电图变化。维拉帕米组：灌流液中以1 mg·L-1浓度加入维拉帕米预灌15 min后，灌流液中加入硫酸亚铁(0.25 mmol·L-1)/抗坏血酸(1.0 mmol·L-1)持续灌注30 min，观察心电图变化。

2.4 实验观察指标

室性早搏(VEB)：指偶发提前发生的室性QRS波，包括二联律；室速(VT)是连续4个(或)以上的VEB；室颤(VF)波幅紊乱且低于正常的QRS波。

心律失常出现时间(min)：指从灌流液中加入硫酸亚铁/抗坏血酸开始至出现心律失常的时间。

心率差：指预灌流K-H液后心电图稳定后的平均心率与灌流液中加入硫酸亚铁/抗坏血酸30 min后的平均心率的差。

心律失常评分法：采用Lambeth会议标准[1]，采用Curtis-Walker法结合Mest法，在每段观察时间内取其最严重的1种心律失常相对应的分数作为其心律失常评分。评分标准如下：0分，无心律失常；1分，房性心律失常，偶发室性早搏(指1 min内发生3次以下的室性早搏)；2分，频发性室性早搏(指1 min内发生3次或3次以上的室性早搏)；3分，偶发性室速(指1 min内发生3次以下的室速)；4分，频发性室速(指1 min内发生3次或3次以上的室速)或偶发性室颤(指1 min内发生3次以下的室颤)；5分，频发性室颤(指1 min内发生3次或3次以上的室颤)或死亡。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 心律失常个数的比较

由表1可知，灌流液中加入硫酸亚铁/抗坏血酸后各组大鼠离体心脏均出现不同程度的心律失常，与对照组相比，KLN胶囊高中低剂量组、维拉帕米组VEB、VT的个数明显减少(P<0.01)，而且呈剂量相关性，KLN胶囊剂量越高出现VEB、VT的个数越少。将KLN胶囊高中低3个剂量组与维拉帕米组比较，结果差异均无统计学意义(P>0.05)。灌流KLN胶囊高中低剂量组、维拉帕米组的大鼠离体心脏均未出现VF，而对照出现VF，但经统计发生个数差异无统计学意义。

表1 各组加入硫酸亚铁/抗坏血酸30 min内出现心律失常个数的比较 /个

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 心律失常出现时间、心率差及心律失常评分的比较

由表2可知，将KLN胶囊高中低剂量组、维拉帕米组分别与对照组比较，KLN胶囊高剂量组心律失常的出现时间明显延迟(P<0.05)，KLN胶囊中低剂量组、维拉帕米组的心律失常出现时间也有延后的趋势，但经统计差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 心律失常出现时间、心率差及心律失常评分的比较

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

实验发现，对照组在灌流硫酸亚铁/抗坏血酸后，心率差为负值，即出现心率加快，而预灌流KLN胶囊和维拉帕米后再灌流硫酸亚铁/抗坏血酸后心率差为正值，即出现心率的减慢，与对照组的心率差值相比差异都具有统计学意义，而且心率差的大小与KLN胶囊剂量呈相关性，KLN胶囊浓度越高则心率减慢越明显。

预灌流KLN胶囊高、中剂量组后再灌流硫酸亚铁/抗坏血酸与对照组相比，心律失常评分明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，而预灌流KLN胶囊低剂量组和预灌流维拉帕米组的心律失常评分与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

4 讨论

再灌性心律失常的发生机制，是国内外心血管研究领域中的热点之一。其发生机制尚未完全阐明，但其生化基础多认为与钙超负荷和氧自由基的大量产生有关。氧自由基参与了缺血时心功能障碍、缺血后心肌“顿挫”和再灌注损伤的病理过程[2-3]。本实验采用硫酸亚铁(0.25 mmol·L-1)/抗坏血酸(1.0 mmol·L-1)作为外源性自由基生成系统，成功复制出自由基致心律失常的模型。

本实验灌流液中加入硫酸亚铁/抗坏血酸后，各组大鼠离体心脏均出现不同程度的心律失常，与对照组相比，KLN胶囊高、中、低剂量组的VEB、VT个数明显减少(P<0.01)，而且呈剂量相关性，KLN胶囊剂量越高出现VEB、VT的个数越少。灌流KLN胶囊高中低剂量组的大鼠离体心脏均未出现VF，而对照组出现VF，但经统计差异无统计学意义。室速、室颤为严重的室性心律失常，是心源性猝死的主要原因之一，因此可以推测KLN胶囊对外源性自由基所导致的心律失常，尤其是对恶性心律失常有很好的预防作用，而且剂量越高作用越强。

实验发现预灌流KLN胶囊后，与对照组相比，高剂量组心律失常首次出现时间明显延迟，中、低剂量组心律失常首次出现时间有延迟的趋势，但与对照组比较差异无统计学意义。预灌流KLN胶囊高、中剂量组后再灌流硫酸亚铁/抗坏血酸与对照组相比，心律失常评分明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；而预灌流KLN胶囊低剂量组的心律失常评分则与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。因此证明KLN胶囊可以剂量依赖性地保护心脏、预防或延迟心律失常的发生。

对照组在灌流硫酸亚铁/抗坏血酸后，出现心率明显加快，用药前后心率差为负值，而预灌流KLN胶囊后再灌流硫酸亚铁/抗坏血酸后出现心率明显减慢，用药前后心率差为正值，与对照组的心率差值相比差异都具有统计学意义，而且心率差的大小与KLN胶囊剂量呈相关性，KLN胶囊浓度越高则心率减慢越明显。因此证明KLN胶囊可以剂量依赖性地降低心率。

维拉帕米为选择性阻滞心肌细胞膜慢钙通道，抑制Ca2+内流，主要影响窦房结、房室结等慢反应细胞。可以抑制4相缓慢去极化，使自律性降低，心率减慢；降低房室结0相去极化速度和幅度，使房室传导速度减慢；使ERP延长，有利于消除折返。维拉帕米对室上性和房室结折返引起的心律失常效果好，阵发性室上性心动过速的急性发作已成为首选。本实验证实预灌流维拉帕米组与对照组相比心率明显减慢(P<0.05)，灌流硫酸亚铁/抗坏血酸后出现VEB、VT、VF的个数明显减少(P<0.01)，心律失常首次出现时间明显延迟，由此可证明其有效性。而将KLN胶囊高、中、低3个剂量组的心律失常个数分别与维拉帕米组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。而且统计后发现KLN胶囊高、中剂量组的心律失常评分要低于维拉帕米组，因此可以推测KLN胶囊对外源性自由基所导致的心律失常的预防作用要优于维拉帕米。

现代研究表明，KLN胶囊组方中很多中药具有清除自由基的作用。当归中的有效成分阿魏酸可直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂质过氧化反应以及与生物膜磷脂结合保护膜脂质等多种机理拮抗自由基对组织的损害[5]。黄连所含的小蘖碱具有清除自由基的作用[4]。酸枣仁中所含的脂肪油、酸枣仁皂苷、黄酮类化合物、阿魏酸等具有清除自由基和抗氧化的作用[6]。

钙超负荷是自由基致心律失常的另一重要机制，KLN胶囊组方药物中的黄连、苦参、生地、当归、酸枣仁均对钙通道有阻滞作用，因此推测KLN胶囊可能具有阻滞钙通道、抑制钙超负荷的作用，从而预防心律失常的发生，具有类似IV类抗心律失常药的特点。

[1] Walker MJ，Curtis MJ，Hearse DJ，et al.The Lambeth conventions：guidelines for the study of aR-Rhythmias in ischemia，infarction and reperfusion[J].Cardiovasc Res，1988；22：447-455.

[2] Joshua I，Goldhaber Sen Ji，Scott T Lamp，et al.Effects of exogenous free radlcal On electromechcal funetion and metabolism in isolated rabbit and guinea pig ventrice[J].J Clinlnvest，1989，83：1800.

[3] EIisabetta Cerbai，Giuseppe Ambrosio，Francesco Porciatti，et al.CeIIuIar eIectrophydioIogicaI basis for oxygen radical-induced arrhythmias.A patch-clam Pstudy in guinea pig ventricuIar myocytes[J].CircuIation，1991，84(4)：1773-1782.

[4] 杨澄，仇熙，孔令东.黄连炮制品清除氧自由基和抗指质过氧化作用[J].南京大学学报，2001，37(5)：32-33.

[5] 王芳，李东.当归的化学及药理研究进展[J].中国药房，2003，14(10)：630-631

[6] 马琦，袁其朋，丁柯，等.酸枣仁抗氧化成分提取及其活性[J].过程工程学报，2010，10(4)：757-758.

EffectofFastLawCapsuleonArrhythmiasInducedbyExogenousFreeRadical

YUXiaoming1*，YANGChuanhua2，LUFeng2

(1.AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330000，China；2.AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250011，China)

Objective：To study the effect of the Fast-law Capsules(KLN) on arrhythmias induced by exogenous free radical，and compare the protective effect，between KLN and verapamil.Methods：SPF SD rats were divided into control group，verapamil group and KLN capsules high，medium and low-dose groups，the method of ferrous sulfate/ascorbic acid Langendoff perfusion of isolated rat heart was applied，exogenous free radicals induced arrhythmias in rats was copied.Results：Compared with the control group，KLN capsule showed a dose-dependent reduction in the number of occurrences of exogenous free radicals induced VEB and VT(P<0.01).VF did not occured in KLN capsule three dose groups and verapamil group，while the control group induced VF，but there was no significant difference(P>0.05) by the statistics.Compared with the control group，the emergence of high-dose group time capsule KLN late arrhythmia(P<0.05)，while the KLN capsule low dose group，verapamil group also has delayed the emergence of arrhythmia trend，but after There was no significant statistical difference(P>0.05).Compared with the control group，pulse rate in KLN capsule three dose groups significantly slowed down，and showed a dose-dependent relationship Compared with the control group，KLN capsule high dose group significantly reduced arrhythmia score(P<0.05)，while the low-dose group and KLN capsule verapamil group were no significant differences( Pand the control group>0.05).Conclusion：KLN capsule has an effect on exogenous free radical-induced arrhythmias，and can slow down pulse rate.Its efficacy is superior to verapamil.

Fast-law capsule；arrhythmia；exogenous free radicals；vitro pharmacodynamics

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.009

2014-11-30)

国家科技重大新药创制专项课题——抗快速性心律失常中药候选新药研究(2009ZX09103-43)

*

于晓明，博士，研究方向：中医药治疗心脑系疾病；E-mail：dryxm@163.com