2-甲氧基雌二醇对4T1、SPC-A1和PC-3细胞的生长抑制作用

王文佳，张正全，贾 欣，李雪冰，张振中

郑州大学药学院郑州 450001

#通讯作者，女，1975年8月生，硕士，讲师，研究方向:肿瘤靶向药物治疗，E-mail:jiaxin@zzu.edu.cn

2-甲氧基雌二醇对4T1、SPC-A1和PC-3细胞的生长抑制作用

王文佳，张正全，贾 欣#，李雪冰，张振中

郑州大学药学院郑州 450001

#通讯作者，女，1975年8月生，硕士，讲师，研究方向:肿瘤靶向药物治疗，E-mail:jiaxin@zzu.edu.cn

2-甲氧基雌二醇;维拉帕米;协同指数;4T1;SPC-A1细胞;PC-3细胞

目的:探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)对多种肿瘤细胞的生长抑制作用。方法:以鼠乳癌4T1细胞株、人肺腺癌SPC-A1细胞株、人前列腺癌PC-3细胞株为研究对象，采用SRB法考察2-ME对多种肿瘤细胞的生长抑制作用，并联合维拉帕米，利用协同指数探讨影响2-ME抗癌作用的因素。结果:2-ME对4T1、SPC-A1和PC-3细胞有不同程度的抑制作用，IC50分别是6.11、1.89和5.12 μmol/L;联合维拉帕米后，抑制率高于单独用药组(P＜0.01)，IC50分别降低至2.01、0.57和2.77 μmol/L，协同指数0.77～0.43。结论:2-ME对3种细胞都有一定的生长抑制作用，维拉帕米对2-ME有明显的增效作用。

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)具有阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡及抑制血管新生的作用［1］，且由于其不良反应小，极具研究价值。乳癌、前列腺癌的致病原因跟雌激素息息相关，作者以鼠乳癌4T1细胞株、人肺腺癌SPC-A1细胞株、人前列腺癌PC-3细胞株为研究对象，采用硫基罗丹明蛋白染料(SRB)法考察2-ME对3种肿瘤细胞的生长抑制作用，并联合维拉帕米，利用协同指数探讨影响2-ME抗癌作用的因素。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药品及主要试剂 3种细胞株由中国科学院上海细胞库提供(目录号分别是TCM32、TCHu53、TCHu158)。RPMI 1640、DMEM培养基(HyClone，北京赛默飞世尔生物化学有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，SRB和Tris碱(美国Sigma公司)，胰蛋白酶(吉诺生物生物医药技术有限公司)。2-ME(自制，纯度＞99.0%)。DMSO等其他试剂均为国产AR级试剂。

1.2 维拉帕米对3种肿瘤细胞的生长抑制作用4T1、SPC-A1和PC-3细胞以每孔5×103mL－1接种于96孔板上，在37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养24 h后更换培养液，加入含总质量浓度为100、80、40、20、10、5 mg/L的维拉帕米培养液，每质量浓度设4个复孔。以空白培养基为阴性对照，再入培养箱于相同条件下继续培养72 h，采用SRB法于570 nm波长处测定各孔吸光度值(A值)，计算抑制率(%)=(1－A/A0)×100%。A:各药物组吸收值，A0:未加药物(对照组)吸收值。

1.3 2-ME对3种肿瘤细胞的生长抑制作用 同1.2的方法培养3种细胞，24 h后更换培养液，分别加入含浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μmol/L的2-ME，每浓度设4个复孔。以空白培养基为阴性对照，后续实验同1.2。

1.4 增效作用研究 向1.3项实验中2-ME作用的4T1、SPC-A1和PC-31细胞同时加入一定量的维拉帕米，其他方法同1.3项，维拉帕米的质量浓度由1.2项确定。

1.5 各组细胞的形态学观察 倒置显微镜下观察各组细胞生长状态及形态变化特点。

1.6 协同指数(CI)计算 采用Chou-Talalay法，计算公式为:CI=D1/DX1+D2/DX2。DX1和DX2分别指两药单独使用时细胞增殖抑制率达X%时的药物浓度，D1和D2指两药联合使用时细胞增殖抑制率达X%时各自的药物浓度。CI＜1.0时表示协同作用，CI=1.0时表示相加作用，而CI＞1.0时则表示拮抗作用。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析。应用Probit法计算IC50值，并在此基础上选用维拉帕米的质量浓度。应用析因设计的方差分析比较2-ME单用及与维拉帕米联合对4T1、SPC-A1和PC-3细胞生长抑制作用的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 维拉帕米对3种肿瘤细胞的IC50维拉帕米对 4T1、SPC-A1和 PC-3细胞的 IC50值分别为(49.05±5.4)、(77.90±11.0)和(44.51±3.9) mg/L。后续实验选用联合维拉帕米的质量浓度为非细胞抑制剂量(10.3 mg/L)。

2.2 2-ME单用及与维拉帕米联合对3种肿瘤细胞的IC50见表1。加入维拉帕米后，2-ME对3种细胞的IC50下降，增敏倍数分别是3.01、3.32和1.85。

表12 -ME单用及与维拉帕米联合对3种细胞的IC50 μmol/L

2.32-ME单用及与维拉帕米联合对4T1、SPC-A1和PC-3细胞生长的抑制作用 见表2～4。由表2～4可知，不同剂量的2-ME对3种细胞的抑制率不同，差异有统计学意义，加入维拉帕米后，抑制率得到提高，且2-ME和维拉帕米有交互效应。

2.5 形态学观察 见图1。倒置显微镜下可见空白对照组的3种细胞形态完整，呈现长梭形或菱形，生长密集，贴壁良好，相互连接成片，胞质透亮。2-ME作用的细胞相互脱离，易浮起，细胞密度下降;且随着作用时间的延长，细胞间的连接断裂、细胞间隙增大，部分细胞体积缩小，核染色质和胞质浓缩，死细胞增多。加入维拉帕米后，相同2-ME作用浓度下，死细胞增多，总体细胞数量明显减少，剂量依赖性更加明显。

表22 -ME单用及与维拉帕米联合对4T1细胞的抑制率(n=4) %

表32 -ME单用及与维拉帕米联合对SPC-A1细胞的抑制率(n=4) %

表42 -ME单用及与维拉帕米联合对PC-3细胞的抑制率(n=4) %

图12 -ME单用及与维拉帕米联合对4T1、SPC-A1和PC-3细胞形态学的影响(×200)

2.6 2-ME联合维拉帕米对3种细胞的CI 4T1、PC-3和 SPC-A1细胞的 CI分别是0.54、0.77和0.43，均＜1，说明有协同作用。

3 讨论

雌激素与乳癌的发生密不可分，身体内雌激素的水平过高会导致乳癌的发生［2］。前列腺的增长和功能的维持依赖于恒定的足够水平的雄激素，在人前列腺基质中存在雌激素受体，通过改变受体表达水平和激活雌激素受体，参与良性前列腺增生及前列腺癌的发生［3］。

2-ME是雌激素的天然代谢产物，在体内细胞中含量量极低。由2-ME对3种肿瘤细胞的IC50可知2-ME对SPC-A1细胞的抑制作用最强，其次是PC3和4T1细胞。分析原因，乳癌和前列腺癌在雌激素的长期刺激下，有可能对和雌激素结构类似的2-ME敏感度下降，疗效降低，导致2-ME对其的抑制作用不如对和雌激素关系欠密切的SPC-A1细胞的强。

有研究［4］表明，癌细胞对某一抗癌药敏感性低或发生耐药性时，其机制大多为抗癌药在细胞内的蓄积浓度下降，维持时间缩短。最近研究［5］认为P-糖蛋白(P-gp)是钙通道的一部分，可被维拉帕米等钙拮抗剂所抑制，减少抗癌药的外流，提高其在细胞内的蓄积浓度，从而增强了药物的抗癌活性。为了证明这一影响因素，作者在2-ME作用于癌细胞的同时加入维拉帕米，考察维拉帕米对2-ME的抗肿瘤增效作用。结果显示加入维拉帕米后2-ME对4T1、SPC-A1和PC-3细胞的IC50均有所下降，协同效应结果也提示维拉帕米可增加2-ME的抗肿瘤效果。

总之，该实验在体外证实钙拮抗剂维拉帕米能增强2-ME对肿瘤细胞的抗癌活性，该结果为2-ME与钙拮抗剂合用治疗癌症的思路提供了一定的实验数据支持。

［1］ Agoston GE，Shah JH，Lavallee TM，et al.Synthesis and structure-activity relationships of 16-modified analogs of 2-methoxyestradiol［J］.Bioorg Med Chem，2007，15(24): 7524

［2］杨契，韩为东，赵亚力.乳腺癌与雌激素及有关内分泌治疗［J］.现代肿瘤医学，2007，15(5):729

［3］Zhou D，Li S，Wang X，et al.Estrogen receptor alpha is essential for the proliferation of prostatic smooth muscle cells stimulated by 17β-estradiol and insulin-like growth factor 1［J］.Cell Biochem Funct，2011，29(2):120

［4］Lewinson O，Lee AT，Locher KP，et al.A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation［J］.Nat Struct Mol Biol，2010，17(3):332

［5］Du Y，Shi WW，He YX，et al.Structures of the substratebinding protein provide insights into the multiple compatible solutes binding specificities of Bacillus subtilis ABC transporter OpuC［J］.Biocherm J，2011，436(2):283

Growth inhibition effects of 2-methoxyestradiol on 4T1，SPC-A1 and PC-3 cells

WANG Wenjia，ZHANG Zhengquan，JIA Xin，LI Xuebing，ZHANG Zhenzhong School of Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

2-methoxyestradiol;verapamil;synergic index;4T1 cell;SPC-A1 cell;PC-3 cell

Aim:To explore growth inhibition effect of 2-methoxyestradiol(2-ME)on a variety of tumor cells.Methods: The study object was 4T1 cell strain of rat mastocarcinoma，SPC-A1 cell strain of human pulmonary adenocarcinoma and PC-3 cell strain of human prostate cancer.SRB method was adopted to investigate growth inhibition effect of 2-ME on the above tumor cells.In addition，verapamil and synergic index were used to explore the factors influencing 2-ME anti-cancer effect.Results:2-ME had inhibition effects on 4T1，SPC-A1 and PC-3 cells with IC50of 6.11，1.89 and 5.12 μmol/L，respectively.After verapamil was adopted，the inhibitory rate was significantly higher than that of the single-drug group(P＜0.01)，and IC50dropped to 2.01，0.57 and 2.77 μmol/L，respectively，with the synergic index distributed within 0.77～0.43.Conclusion:2-ME has inhibition effects on the three kinds of tumor cells，and verapamil has obvious synergistic effect on 2-ME.

R979.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.017

(2012-03-11收稿 责任编辑赵秋民)