十精丸中菊花、枸杞养肝药对组合抗皮肤光老化作用的研究

陈丽娟,徐姣,谷建梅,徐艳明,祁永华,王业秋,张宁

.基础研究.

十精丸中菊花、枸杞养肝药对组合抗皮肤光老化作用的研究

陈丽娟,徐姣,谷建梅,徐艳明,祁永华,王业秋,张宁

(黑龙江中医药大学佳木斯学院黑龙江佳木斯154007)

目的:探讨十精丸中菊花、枸杞养肝药对组合抗皮肤光老化的作用及机制.方法:观察菊花、枸杞养肝药对组合对紫外线照射大鼠皮肤和血清中抗氧化酶系活力及羟脯氨酸含量的影响.结果:菊花、枸杞养肝药对高、中、低剂量组皮肤及血清中抗氧化酶系活力及羟脯氨酸含量高于模型对照组,尤以高剂量组明显.结论:十精丸中菊花、枸杞养肝药对组合能够改善皮肤光老化状态,具有抗皮肤光老化的作用.

十精丸;菊花;枸杞;光老化;氧化应激

紫外线照射后产生的氧自由基损伤是导致皮肤光老化的重要原因,当前空气污染日益严重,天然紫外线透入量日益增加,皮肤光化损害现象也日益严重.由紫外线引起皮肤老化的发生机制十分复杂.目前国内外对其研究尚未得出明确结论,因此,选用行之有效的经典方剂进行综合调理,是十分必要的.

十精丸出自明代《普济方.诸虚门》,是中医美容保健,延年益寿之传统名方[1].有"温肾滋肾,益精填髓,养心益智,平肝明目,乌须发,悦容颜"的作用.本课题组以十精丸中菊花、枸杞药对组合为研究对象,探讨养肝中药在皮肤光老化防治中的作用.

1　材料

1.1受试药物

菊花、枸杞(十精丸中养肝药对).购于黑龙江中医药大学佳木斯学院附属医院中药局.

1.2阳性对照药

三精维生素E由哈药集团三精医药商贸有限公司生产,批号:20140401.

1.3仪器

紫外照射仪(Sigma公司),紫外线辐照计(北京师范大学光电仪器厂),ResecarchUVUF型超纯水制备系统(上海和泰仪器有限公司),MS-500A半自动生化分析仪(美生科技有限公司),TGL-16G-C型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),DY89-I电动玻璃匀浆机(上海民仪电子有限公司).

1.4试剂

羟脯氨酸(HYP)试剂盒产品批号:20141006南京建成生物工程研究所;SOD测定试剂盒产品批号:20141006南京建成生物工程研究所;MDA测定试剂盒产品批号:20141006南京建成生物工程研究所;GSH-Px试剂盒产品批号:20141006南京建成生物工程研究所;CAT试剂盒产品批号:20141006南京建成生物工程研究所;H2O2测定试剂盒产品批号:20141006南京建成生物工程研究所;乙醇、无水乙醇、二甲苯、苏木精、硫酸铝钾、蒸馏水、0.5%伊红、盐酸等均为市售分析试剂.

2　方法

2.1光老化模型建立及分组

wistar(14～16月龄)大鼠60只,雌雄各半,体重(280±20)g,佳木斯大学实验动物中心提供.适应性饲养1周,随机分成6组,每组10只,即空白对照组(control groupctl)、模型组(model bank, MB)、菊花、枸杞养肝药对低、中、高组(D、Z、G)、阳性对照组(Positive control group,PCG).

各组大鼠背部剃毛,空白对照组只剃毛不照射.根据测得的最小红斑面积(MED),UVA照射剂量每次约为29J/cm2,UVB约为64.mJ/cm2,用紫外线测量仪来测量.每次照射时间为1h,2周后,每次照射时间增加为2h.

2.2药物制备

本课题组前期研究已确定了十精丸美容作用的最佳剂量[2],本研究在最优剂量基础上,按中医学方剂配伍理论将十精丸菊花、枸杞养肝药对按原有剂量水煎.置4℃冰箱保存,灌胃给药,使用前水浴至30℃,实验周期6周.

2.3标本制备

2.3.1血清制备:于最后一次给药后,禁食不禁水12h,乌拉坦腹腔注射麻醉后,门静脉采血3～5ml,以3 000r/ min,低温离心15min,吸取血清0.5ml于灭菌离心管中. 2.3.2皮肤组织匀浆的制备:①每只大鼠在背部剪取约1cmX1cm大小的皮肤组织,在预冷生理盐水中漂洗3次,除去血液,用滤纸拭干,用眼科剪刀剪碎组织块,将剪碎的组织倒入剥离匀浆管中;②量取4ml预冷生理盐水,倒入匀浆器中进行充分匀浆(冰水浴中进行);③将匀浆液以4 000r/min的速度低温离心l5min;④取上清液备用.

2.4皮肤组织病理学检测取材

于大鼠背部正中,剪取1cmX1cm皮肤,去处脂肪,预冷生理盐水清洗3遍,以10%甲醛固定待检;

2.5光镜标本检查

将经4%多聚甲醛固定24h以上的各组大鼠皮肤、卵巢标本,经酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,常规切片(5μm),HE染色,光学显微镜观察.

表1　各组大鼠血清氧化应激水平结果

表2　大鼠皮肤组织中胶原与抗氧化酶测定结果

2.6统计学处理

图1　菊花、枸杞药物组高剂量组(光镜下200X)

图2　菊花、枸杞药物组低剂量组(光镜下200X)

图3　阳性对照组(光镜下200X)

图4　空白对照组(光镜下200X)

计量资料以x±s表示,数据处理全部采用t检验,P<0.05差异显著.

3　实验结果

3.1大鼠血清氧化应激指标测定结果

各给药组血清抗氧化酶系明显高于模型组,高、中剂量组与空白对照组、模型组相比差异极显著(P<0.01)有统计学意义,低剂量组与空白对照组、模型组相比差异较为显著(P<0.05).结果表明十精丸中菊花、枸杞养肝药对能不同程度地提高受试大鼠血清抗氧化酶水平,减少MDA含量,提示其具有提高机体整体抗氧化功能、修复皮肤光损伤、改善皮肤光老化的作用.

各给药组皮肤组织中抗氧化酶水平和胶原含量明显高于模型组,高、中剂量组与空白对照组、模型组相比差异极显著(P<0.01)有统计学意义,低剂量组与空白对照组、模型组相比差异较为显著(P<0.05).结果表明十精丸中养肝药对能不同程度地提高受试大鼠皮肤组织中抗氧化酶水平,减少MDA含量并提高胶原含量,提示十精丸中的养肝药对在皮肤局部也具有提高抗氧化功能、减轻辐射损害,修复皮肤光损伤的作用.

3.2组织形态学观察结果

各组大鼠皮肤组织形态学观察(光镜200X)见各图1～4.

菊花、枸杞药对(图1、图2):以高剂量改变明显,表皮角化层变薄,基底层色素沉着明显减轻;真皮层变厚,胶原纤维致密丰富,腺管扩张,分泌旺盛.

阳性药对照组(图3):表皮角化层较厚,基底层色素沉着明显,真皮胶元纤维细胞稍多,汗腺、皮脂腺变化不明显.

空白对照组(图4):表皮角化层厚,基底层色素沉着明显,真皮层胶元纤维细胞稀疏,有玻璃样变,皮脂腺汗腺腺管无显著改变.

4　讨论

目前预防和治疗皮肤光老化的措施,多集中使用防晒化妆品、口服或外用抗氧化剂等方面.但是,现在所使用的这些抗氧化剂有的化学性质不稳定,有的则需要较高浓度才能起作用,因此有必要寻找开发新的高效抗氧化剂,以增强抗光损伤的功效,达到预防皮肤光老化的目的.中药美容、延缓皮肤衰老的历史悠久、疗效可靠、安全性高,应充分发掘其在这方面的潜力和优势.

在中药或天然植物中寻找高效安全的自由基清除剂的研究,是当前医药学和日用化学品科学中一个十分热门的研究方向[3-4].

肝与面部肌肤状态关系极为密切.肝主疏泄,司血海,与肾、脾等-参与气血的生成、统摄与运行,调节诸脏腑功能,使气血充盛调和,上荣于头面,以滋养面部肌肤,因此面色反映气血之变,也可察知肝之功能,故谓肝其华在面[5].肝为气机升降之枢,全身气血津液运行主要取决于肝[6],肝的功能正常,脾运健旺,化源充沛,气血运行流畅则可延年悦面、抗衰驻颜.

紫外线照射可直接导致DNA的光激发,并且活性氧族和氧自由基损伤皮肤已经被广泛的认为是紫外线产生光毒性的机制之一[7-9].

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)可解除脂类和过氧化物的毒性.从而提高了皮肤组织清除自由基与抗氧化的能力,同时也降低了对细胞组织的氧化性损伤,这对改善衰老皮肤细胞功能活性、提高皮肤防护能力、延缓皮肤衰老具有积极的意义.皮肤中的羟脯氨酸含量稳定,其含量可以直接反应出真皮内胶原纤维的含量变化.所以其含量变化可以作为判定皮肤老化程度的一个敏感的指标[10].综合本研究中各组比较结果及皮肤组织病理图片表明,十精丸中养肝药对能不同程度地提高受试大鼠皮肤组织中抗氧化酶水平,减少MDA含量,提高胶原含量,提示十精丸中养肝药对在皮肤局部也具有提高抗氧化功能、减轻辐射损害,改善并修复皮肤光老化损伤的作用.

[1]明.朱橚.普剂方[M].北京:人民卫生出版社,1983:185-226.

[2]陈丽娟,王兴炎,董兴中,等.十精丸延缓大鼠皮肤衰老作用的实验研究[J].中国美容医学,2008,17(10):1485-1487.

[3]陈俊杰,王秋.甘寒生津药抗皮肤光老化的研究进展[J].中医临床研究,2014,6(11):8-10.

[4]马卓飞,郑莹,林艳明.中草药防治皮肤光老化机制研究现状[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(1):209-211.

[5]徐中环.试论肝其华在面[J].光明中医,2004,19(4):3-5.

[6]谢莉.浅谈"肝主疏泄"与中医美容[J].辽宁中医药大学学报,2007,9(6):51-52.

[7]Cadet J,Douki T,Ravanat JL,et al..Sensitized formation of oxidatively generated damage to cellular DNA by UVA radiation[J].Photochem Photobiol Sci.2009,8(7):903-911.

[8]陈国建,邹凡凯,石萌萌,等紫外线A对家兔皮肤的氧化损伤研究[J].现代预防医学,2014,3(41):419-428.

[9]殷花,林忠宁,朱伟.皮肤光老化发生机制及预防[J].环境与职业医学,2014,31(7):565-569.

[10]郑瑞,张嘉,董志姗,等弹性纤维在皮肤光老化进程中变化的相关研究[J]中国美容医学,2014,23(10):818-820.

编辑/张惠娟

Study on the effect of light aging resistance of chrysanthemum and chinese wolfberry in shijingwan

CHEN Li-juan,XU Jiao,GU Jian-mei,XU Yan-ming,QI Yong-hua,WANG Ye-qiu,ZHANG Ning
(Jiamusi College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)

Objective To investigate the Lycium chrysanthemum medicine on skin anti light aging pro⁃tection mechanism.Methods To observe the effect of anti oxidative enzymes activity,hydroxyproline content in skin and serum of rat Lycium chrysanthemum of UV irradiation in.Results Lycium chrysan⁃themum to the senior high school group,low dose in skin and serum antioxidase activity,hydroxyproline content was higher than that of the model control group,especially in the high dose group.Conclusion Lycium chrysanthemum can improve the state of skin photoaging with anti photoaging skin old role.

Shijingwan;Chrysanthemum;Chinese wolfberry;Light aging;oxidative stress

R285.5

A

1008-6455(2015)07-0037-03

1.黑龙江省教育厅科学技术研究(面上)项目"十精丸抗ESF-1细胞光老化的作用机制研究"(项目编号:12531630);黑龙江省自然科学基金面上项目"十精丸抗皮肤光老化作用及对关键因子影响的研究"(项目编号:D201231);黑龙江省中医管理局中医药科研项目"十精丸抗皮肤光老化及相关细胞因子作用机理的研究"(项目编号:ZHY12-Z066)

徐姣,女,硕士研究生,主要从事美容化妆品配方设计的教学与研究工作;E-mail:xujiao2007@sina.com

2015-03-05

2015-04-17