慢性乙型肝炎患者外周血调节性T细胞及其相关细胞因子水平检测及临床意义*

李彩东，陈锡莲，田鹏飞，李惠军，吴 斌

慢性乙型肝炎的发病机制复杂。国内外学者认为导致慢性肝损伤的主要原因是机体免疫调控紊乱。CD4+CD25+调节性T细胞（T regulatory cells，Tregs）具有免疫抑制功能，能在自身免疫性疾病、肿瘤免疫、移植免疫[1]发生发展过程中发挥重要作用[2]。Th1/Th2细胞失衡可能是HBV感染慢性化的机制之一[3]。因此，针对慢性乙型肝炎患者Th1和Th2类细胞因子的研究也是慢性乙型肝炎发病机制研究的热点之一。Th1型细胞因子主要有白细胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）等，Th2型细胞因子有转化生长因子 β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）等[4]。本研究旨在探讨 HBV 感染者外周血 CD4+CD25+Treg及 IL-18、IFN-γ、TGF-β 水平的变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1 病例来源 2012年7月～2012年12月我院门诊和住院收治的慢性乙型肝炎（CHB）患者63例，男性30例，女性33例；年龄21～57岁，平均年龄（37.28±12.08）岁。HBV携带者（ASC）112例，男性69例，女性43例；年龄28～63岁，平均年龄（41.45±13.17）岁。诊断符合2010年12月中华医学会肝病学会和感染病学会联合修定的慢性乙型肝炎防治指南[5]的标准。所有患者均未接受过免疫调节和抗病毒治疗，6个月内未接受过保肝治疗。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝损伤。另选择同期门诊健康体检者50例，男性25例，女性25例；年龄23～58岁，平均年龄（38.6±13.1）岁，排除各型肝炎病毒感染，排除心肺疾病，肝功能正常。

1.2 外周血CD4+CD25+调节性T细胞检测 空腹取外周血2 ml，乙二胺四乙酸二钾（EDTAK2）抗凝，在样品测定管中加入抗凝血50μl，加入抗CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP单克隆抗体20μl（购自美国Bectond-Dickinson公司），振荡混匀，室温避光孵育20 min，加入溶血素2 ml，振荡混匀，室温避光放置15 min。1500 r/m离心5 min，弃上清液。加入PBS 2 ml，1500 r/m离心5 min，弃上清液，重复一次。加入PBS 500μl，上机（FACSV Verse流式细胞分析仪，美国Becton-Dickinson公司）检测。全部数据用流式细胞仪和BD FAC Suite软件系统进行荧光参数获取和分析。

1.3 血清IL-18、IFN-γ和TGF-β检测 采用 ELISA法检测（美国R＆D公司），使用ST-360型酶标仪（上海科华）。根据标准品不同浓度的OD450值，绘制标准曲线，求出标准方程，然后换算出每个待测标本细胞因子水平。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以（）表示，采用 t检验和 Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性HBV感染者外周血调节性T细胞及其细胞因子水平变化 见表1。

表1 3组人群外周血CD4+CD25+Treg(%)和细胞因子水平（ng/ml，）比较

表1 3组人群外周血CD4+CD25+Treg(%)和细胞因子水平（ng/ml，）比较

与健康人比，①P<0.01；②P<0.05

例数 Treg细胞 IL-18 IFN-γ TGF-β健康人 50 27.30±17.59 49.79±25.68 14.41±11.75 42.28±17.50 ASC 112 28.17±18.52 524.52±81.42 204.93±47.77 336.01±82.61 CHB 63 30.97±18.78 448.51±75.75 190.93±38.52 331.22±71.67

2.2 不同HBV感染者肝功能和HBV DNA水平比较 见表2。

表2 3组人群肝功能和HBV DNA水平（）比较

表2 3组人群肝功能和HBV DNA水平（）比较

与健康人比，①P<0.01；②P<0.05

例数 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg IU/ml）健康人 50 19.90±3.95 15.38±2.68 13.67±2.30 -ASC 112 26.29±9.18 32.18±15.42 27.82±62.07 2.81±2.85 CHB 63 269.39±38.55 210.35±30.97 65.85±92.34 5.49±1.99

2.3 不同HBV DNA载量ASC人群外周血CD4+CD25+Treg和细胞因子水平比较 见表3。

表3 不同HBV DNA载量ASC外周血CD4+CD25+Treg和细胞因子

2.4 不同HBV DNA载量CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和细胞因子水平比较 见表4。

表4 不同HBV DNA水平CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和细胞因子水平（）比较

表4 不同HBV DNA水平CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和细胞因子水平（）比较

与其他两组比，①P<0.01；与中水平组比，②P<0.05，与低水平组比，P<0.01

HBV DNA载量例数CD4+CD25+（%）IL-18（ng/ml）IFN-γ（ng/ml）TGF-β（ng/ml）高水平 18 32.45±17.45 44.79±25.68 24.82±7.92 48.01±0.58中水平 19 30.56±18.59 40.52±17.76 23.13±8.25 44.45±0.76低水平 26 30.86±19.03 41.22±18.98 20.05±9.51 41.41±0.63

3 讨论

CD4+CD25+Treg是一群起负性调节的免疫抑制性T细胞，在外周血中约占CD4+T淋巴细胞的5%～10%，在1995年由Sakaguchi et al首次发现并报道。大量研究证实，CD4+CD25+Treg细胞数量减少及其免疫功能受损与机体自身免疫性疾病的发生关系密切。目前，许多学者认为CD4+CD25+Treg可抑制HBV抗原特异性T细胞，与慢性乙型肝炎的慢性化相关[7]。细胞因子作为宿主对炎症反应产生的重要免疫调节介质，在宿主清除病毒的免疫应答和抗肿瘤过程中发挥重要作用。细胞因子、CD4+CD25+Treg和Th1/Th2细胞失衡，都可引起免疫系统的异常，导致乙型肝炎慢性化。因此，细胞因子作为宿主对炎症反应产生的重要免疫调节介质，在宿主清除HBV的免疫应答过程中发挥重要的作用。让我们感兴趣的是慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg及细胞因子IL-18、IFN-γ、TGF-β水平与HBV DNA载量之间是否存在联系，我们能否通过研究两者之间的关系，为治疗乙型肝炎提供依据。

本研究结果显示，与健康对照组比较，乙型肝炎病毒携带者和慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg均升高，但CHB组患者CD4+CD25+Treg显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），证实慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+Treg百分数较正常人升高。HBV特异性CD4+CD25+Treg细胞的存在可能抑制HBV特异性免疫应答，使得机体无法充分清除病毒，从而导致持续感染。我们还发现CHB患者较ASC外周血CD4+CD25+Treg升高，提示慢性HBV感染过程中宿主出现过度的免疫病理损伤和炎症反应导致T细胞被不同程度激活，CD4+T细胞分化为CD4+CD25+Treg细胞增多，从而使CD4+CD25+Treg细胞数量增加，表明 CD4+CD25+Treg细胞参与了慢性乙型肝炎的发病过程。

CD4+CD25+Treg细胞是一种免疫抑制细胞，它的增加是否与这类患者难以清除HBV有关？本研究发现，CHB组和ASC组CD4+CD25+Treg与HBV DNA载量有关，与Stoop et al的报道相一致。病毒复制越活跃的患者体内调节性T细胞的比例越高，说明机体可能通过Treg的免疫抑制效应促进了病毒的复制，提示Treg在慢性乙型肝炎的免疫耐受中起一定的作用，CD4+CD25+Treg升高也可能是慢乙型肝炎患者难以清除乙型肝炎病毒的因素之一。

本研究共选取慢性乙型肝炎患者63例、HBV携带者112例和健康对照组50例，对其外周血IL-18、IFN-γ、TGF-β水平进行了检测。结果表明，ASC组和CHB组患者外周血IL-18、IFN-γ、TGF-β水平均显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。CD4+CD25+Treg能够分泌细胞因子TGF-β，其水平升高提示CD4+CD25+Treg作为抑制性免疫细胞，通过分泌TGF-β，下调免疫功能，抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化，阻碍HBV的清除，导致乙型肝炎慢性化的发生和发展。IL-18能促进T细胞增殖产生IFN-γ，增强Th1类反应，提示Th1占优势，机体以细胞免疫为主，细胞免疫功能受到抑制，出现Th1/Th2的失衡。

本研究结果在一定程度上提示CD4+CD25+Treg和部分细胞因子参与了乙型肝炎发病的慢性化过程，这对进一步研究其在慢性乙型肝炎患者发病机制中的作用，为以CD4+CD25+Treg和细胞因子作为治疗靶点的策略提供了新的思路和方法。

[1]庄勤建，邱隆敏，姚新生，等.CD4＋CD25＋调节性T细胞与乙型肝炎病毒感染的研究进展.世界华人消化杂志，2012，20（24）:2248-2253.

[2]吴银亚，谭善忠.CD4＋CD25＋调节性T淋巴细胞在慢性乙型肝炎发病机制中的作用. 中华传染病杂志，2012，30（9）：563-565.

[3]孙学华，刘巧丽，李曼，等.慢性乙型肝炎患者CD4+和CD8+T细胞亚群的研究. 细胞与分子免疫学杂志，2011，27（5）：545-547.

[4]Fabrizi F，Dixit V，Martin P，et al.Meta-analysis:The impact of nutritional status on the immune response to hepatitis B virus vaccine in chronic kidney disease.Dig Dis Sci，2012，（5）:1366-1372.

[5]中华医学会肝病学分会和感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.实用肝脏病杂志，2011，14（2）：81-89.

[6]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Shimizu J，et al.Immunologic tolerance maintained by CD25+CD4+regulatory T cells:their common role in controlling autoimmunity，tumor immunity，and transplantation tolerance.Immunol Rev，2001，182:18-32.

[7]Yang PI，Althage A，Chung J，et al.Immune effectors required for hepatitis B virus clearance.Proc Nat1 Acad Sci USA，2010，107（4）:798-802.