蛋白激酶SGK3基因的克隆及其在乳腺癌细胞中的表达

郭红艳 孙晓杰 李淑艳 刘秀财 刘 波 王宏兰 蒋瑞雪

(齐齐哈尔医学院生物化学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

蛋白激酶(SGK)可能作为多种细胞信号转导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，通过作用于下游底物参与信号通路和细胞应答反应的调节，并且在肿瘤的形成、肿瘤细胞浸润或迁移及恶性转化过程中起到重要的作用〔1，2〕。N-端增强型绿色荧光蛋白(pEGFP-N1)具有复制能力强、检出率高、无细胞毒性、易于构建融合蛋白等特点，是常用的表达载体。本实验利用DNA重组技术方法构建pEGFP-N1-SGK3重组质粒，为SGK3与肿瘤发生发展的相关性后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和质粒 乳腺癌细胞株MCF-7由中国医学科学院肿瘤研究所提供，细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃、5%CO2条件下培养。本研究所用pAcG-4T3-SKG3质粒由美国霍普金斯大学医学院夏献民博士惠赠，pAcG-4T3-SKG3质粒含有人SGK3 cDNA基因，全长为1.3 kb，含BamH I和Xho I酶切位点。

1.1.2 主要试剂和抗体 RPMI1640细胞培养基(Gibco)、新生牛血清(PAA)、胰酶(DIFCO)购买于Invitrogen(USA)公司;细胞培养瓶、培养板购自英国Nunc公司;BamH I和Xho I购自宝生物工程有限公司;anti-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、anti-SGK3、购自美国CST公司，二抗购自美国SANTA CRUZ公司，本研究所用引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR获取目的基因 提取pAcG-4T3-SKG3质粒，根据SGK3和pEGFP-N1载体的序列，选择XhoⅠ和BamH I酶切位点，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，通过聚合酶链反应(PCR)方法从pAcG-4T3-SKG3质粒中扩增目的基因，SGK3正义序列:5'CCGCTCGAGACCATGGCCCTGAAGATTC3'，反义序列:5'CGCGGATCCAAAAATAAGTCTTCTG 3'。PCR反应条件:95℃ 预变性10 min，95℃变性 45 s，50℃ 退火 45 s，72℃ 延伸80 s，循环30 次，72℃，10 min，4℃ 保存。PCR 产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳，回收SGK3基因片段。

1.2.2 pEGFP-N1-SGK3重组质粒的构建 纯化后的PCR产物经限制性内切酶XhoⅠ和BamH I双酶切后与同样酶切的载体pEGFP-N1进行连接，连接产物转化至大肠杆菌(DH5α)感受态菌中，继而将其转移到含Kanamycin的LB琼脂培养基上，观察菌落生长情况;挑菌进行菌落PCR，提取质粒，进行双酶切鉴定，阳性菌株送至上海invitrogen公司进行测序，测序结果与Genbank源基因用软件网络ClustalW进行基因比对，将鉴定后的重组质粒命名为pEGFP-N1-SGK3。

1.2.3 基因转染 采用GenEscortTMⅠ 进行细胞转染，生长良好的MCF-7细胞于转染前24 h接种到6孔板中，待细胞总面积达到60% ～80%，取3 μg pEGFP-N1-SGK3质粒进行基因转染，同时转染pEGFP-N1空载体作为对照(具体操作按说明书进行)。在转染后48 h，在荧光显微镜下观察pEGFP-N1表达情况，确定转染效率。

1.2.4 Western印迹检测融合蛋白表达 收集各组细胞，提取细胞总蛋白并测定细胞总蛋白浓度。取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，将硝酸纤维素(NC)膜用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，按1∶1000稀释一抗，4℃孵育过夜，洗膜后，加入1∶5000的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2 h，用Tris盐酸缓冲液(TBST)室温漂洗后显影，采用化学发光法(ECL)曝光胶片，冲洗显色检测相应的蛋白条带，GPS8000型凝胶成像分析系统扫描分析蛋白条带。

2 结果

2.1 重组表达载体菌落PCR 平板菌落密集，圆形，稍凸起，大小中等，分布均匀，边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑，呈乳白色。为初步确定重组质粒构建结果，挑4～6个单菌落进行PCR，产物序列大小与目标条带一致。见图1。

图1 重组表达载体菌落PCR

2.2 重组质粒pEGFP-N1-SGK3的酶切鉴定 重组质粒pEGFP-N1-SGK3经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果可见约1.3 kb的DNA带，表明所获SGK3酶切片段的大小与预期相符。见图2。

2.3 测序鉴定转化菌 对转化菌的质粒进行DNA测序，测序结果表明，所选送测序的重组表达载体碱基序列完全正确，见图3。

图2 重组质料pEGFP-N1-SGK3的酶切鉴定

图3 测序结果

2.4 转染效果评价 转染后48 h后倒置荧光显微镜观察，视野内有较强的绿色荧光，即证明有绿色荧光蛋白GFP的表达。说明各表达载体成功转染入乳腺癌mCF-7细胞中。见图4。

图4 转染效果评价

2.5 转染细胞中SGK3蛋白表达的鉴定 重组质粒pEGFPN1-SGK3和空载体质粒pEGFP-N1分别转染MCF7后，通过Western印迹方法用抗GFP的抗体对转染细胞中融合蛋白SGK3-GFP的表达进行检测，结果发现SGK3在MCF-7细胞中能够表达，且融合蛋白SGK3-GFP的表达量(0.7081±0.0595)略高于空载体中GFP的表达量(0.5847±0.0251)。见图5。

图5 Westem印迹法检测转染细胞中融合蛋白SGK3-GFP的表达

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，目前该病被认为是影响女性身心健康乃至危及生命的杀手之一〔3〕，现代免疫学、分子生物学技术得以迅速发展，人类对乳腺癌发病机制研究不断深入，多种乳腺癌相关基因被陆续发现并进行广泛研究，基因靶向治疗逐渐成为乳腺癌生物学治疗中的重要部分〔4〕。

通过磷酸蛋白组学筛选和功能基因组研究发现，许多肿瘤细胞系表现出SGK3的依赖性〔1〕。在前列腺癌、卵巢癌和肝癌中等多种肿瘤中都发现了SGK3的表达与正常组织有较大差异。已有证据提示SGK3可作为某些肿瘤的预后标志物和用于治疗肿瘤的新目标〔5〕。对该基因与乳腺癌的发生发展的相关性研究国内外至今鲜有报道。本实验测序结果表明，成功构建真核表达载体pEGFP-N1-SGK3，经多次转染条件的摸索，利用高效GenEscortTMI基因转染试剂将SGK3转染MCF-7人乳腺癌细胞，使之转染MCF7细胞后48 h转染效率达70%以上，Western印迹方法检测证实，目的基因在乳腺癌细胞中能够有效地表达。上述研究为进一步研究SGK3与乳腺癌发生发展的关系及其对乳腺癌的恶性行为的影响极其机制研究等后续工作打下了基础。

1 Wang Y，Zhou D，Phung S，et al.SGK3 is an estrogen-inducible kinase promoting estrogen-mediated survival of breast cancer cells〔J〕.Mol Endocrinol，2011;25(1):72-82.

2 Liu M，Chen L，Chan TH.Serum and glucocorticoid kinase 3 at 8q13.1 promotes cell proliferation and survival in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology，2012;55(6):1754-65.

3 潘 峰，潘跃银.乳腺癌分子靶向治疗的新进展〔J〕.中华疾病控制杂志，2010;14(6):566-9.

4 张柏林，宋丰举.乳腺癌基因组学研究进展〔J〕.中国肿瘤临床，2014;41(3):207-10.

5 Liu HK，Wang Q，Li Y，et al.Inhibitory effects of γ-tocotrienol on invasion and metastasis of human gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells〔J〕.J Nutr Biochem，2010;21(2):206-13.