雷公藤红素通过ROS-JNK信号通路诱导T98G细胞发生凋亡

丁成国（杭州市第一人民医院，浙江 杭州310006）

·实验研究·

雷公藤红素通过ROS-JNK信号通路诱导T98G细胞发生凋亡

丁成国
（杭州市第一人民医院，浙江 杭州310006）

目的探讨雷公藤红素对人胶质母细胞瘤细胞系T98G的生物效应及其机制。方法将人胶质母细胞瘤细胞系T98G用各种不同浓度的雷公藤红素处理后，采用MTT法检测雷公藤红素对T98G细胞活力的抑制作用；采用流式细胞术检测T98G细胞用雷公藤红素处理后细胞的凋亡情况及ROS的产生；Western blot检测T98G细胞用雷公藤红素处理后cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表达水平。结果雷公藤红素对T98G细胞活力的抑制效应呈剂量依赖性，1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L雷公藤红素组细胞活力抑制率分别为（15.3±1.1）%，（28.2±1.8）%，（37.4±2.6）%，（55.6±3.8）%，（71.3±5.1）%。雷公藤红素可显著诱导T98G细胞发生凋亡，对照组的凋亡率为 （2.1±0.3）%，1μmol/L雷公藤红素组凋亡率为 （10.4±0.9）%，3μmol/L雷公藤红素组凋亡率为 （22.5± 1.7）%。雷公藤红素可显著诱导T98G细胞ROS的产生，并使cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表达水平显著上升。结论雷公藤红素在体外有良好的抗神经胶质母细胞瘤的生物活性，诱导T98G细胞凋亡的机制可能与激活ROS-JNK信号通路有关。

雷公藤红素；T98G；凋亡；ROS；JNK

近年的研究发现，雷公藤红素除了有抗炎抗氧化作用外，对离体培养的肿瘤细胞有较强的抑制作用［1-2］。为此，作者进行雷公藤红素体外激活ROS-JNK/caspase信号通路，抑制神经胶质母细胞瘤细胞的活力并使其发生凋亡的实验，探讨雷公藤红素抑制人神经胶质母细胞瘤细胞系T98G的分子机制。

1　材料与方法

1.1细胞培养本实验研究的起止时间为2013 年12月～2015年3月。人胶质母细胞瘤细胞系T98G购于美国 ATCC（American Type Culture Collection，#CRL-1690），肿瘤细胞培养在RPMI-1640培养基中，含10%胎牛血清，培养环境为37℃恒温且通入5%的CO2。肿瘤细胞2天传代1次，待培养至对数生长期，供实验用。

1.2实验试剂RPIM-1640培养基购于Gibco公司（#11875-085）。胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司 （HB0205）。雷公藤红素（celastrol，#C0869）购自美国Sigma Aldrich公司。二氢乙啶，N-乙酰半胱氨酸 （NAC，#A7250），SP600125（SP，#S5567），四甲基偶氮 （噻唑蓝，MTT，#M2128），AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒（#APOAC）均购于美国 Sigma Aldrich公司。β-actin （#4967）、cleaved caspase-3（激活型 caspase-3，#9661）、cleaved caspase-9（激活型 caspase-9，#7237）、p-JNK（激活型磷酸化JNK，#9255）抗体购自美国Cell signal公司。

1.3MTT试验细胞活力检测分组参照文献进行［2］，将T98G细胞按5×103/孔接种于96孔板，分别加入 1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L的雷公藤红素，对照组不加药物作为空白对照，所有组别设置3个复孔。培养48小时后加入5mg/ mL MTT 20μL，继续培养4小时。弃上清后，加二甲亚枫溶解细胞并显色，震荡使紫色絮状物完全溶解，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率计算公式：抑制率=（OD对照组-OD实验组）/OD对照组×100%。

1.4细胞凋亡试验在T98G细胞中分别加入1μmol/L、3μmol/L的雷公藤红素，对照组不加药物，所有组别设置3个复孔。培养48小时后将细胞用生理盐水洗涤2次，按照凋亡试剂盒说明书步骤将Annexin-V加入细胞中孵育20分钟，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，细胞凋亡率用Annexin-V阳性细胞占所有细胞比值表示。

1.5ROS（活性氧簇）检测在T98G细胞中分别加入3μmol/L的雷公藤红素，对照组不加药物，所有组别设置3个复孔。培养48小时后将细胞用生理盐水洗涤2次，将5μM二氢乙啶加入细胞中孵育20分钟，采用流式细胞术检测肿瘤细胞ROS的产生，ROS阳性细胞发射红色荧光，因此肿瘤细胞ROS阳性率用发出红色荧光的细胞占所有细胞比值表示［3］。

1.6Western blot试验在 T98G细胞中加入1μmol/L或3μmol/L雷公藤红素，对照组不加药物。培养48小时后将细胞用生理盐水洗涤2次，之后将细胞裂解，将蛋白裂解液用 12.5%SDS PAGE进行分离，之后通过电转方法将蛋白质转到PVDF膜上。将膜放入β-actin，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9，p-JNK一抗稀释液中孵育过夜，之后再用二抗稀释液孵育2小时后在X线胶片上进行曝光，之后用Image J图像处理软件进行处理，使蛋白表达灰度值用数字表示，目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/相应β-actin内参蛋白灰度值。

2　结果

2.1雷公藤红素对人胶质母细胞瘤细胞系T98G的抑制作用雷公藤红素有显著的体外抗胶质母细胞瘤作用，T98G细胞在不同浓度雷公藤红素的作用下，其细胞活力均受到显著抑制，见表1。

2.2雷公藤红素诱导T98G发生caspase依赖的凋亡高低浓度的雷公藤红素 （1μmol/L和3μmol/L）均能诱导T98G发生凋亡（图1），同时激活caspase-9 和caspase-3（图2），当用caspase特异性抑制剂zVAD-fmk［3］抑制T98G细胞caspase的活性后，雷公藤红素对T98G细胞的凋亡诱导效应受到抑制，表明雷公藤红素能诱导胶质母细胞瘤细胞发生caspase介导的凋亡，见表2。

表1　不同浓度雷公藤红素对T98G胶质母细胞瘤细胞的抑制作用（±s）

表1　不同浓度雷公藤红素对T98G胶质母细胞瘤细胞的抑制作用（±s）

与对照组比较*P＜0.05

组别　n/孔　细胞活力抑制率（%）对照组　3　0 1μmol/L雷公藤红素组　3　15.3±1.1*2μmol/L雷公藤红素组　3　28.2±1.8*3μmol/L雷公藤红素组　3　37.4±2.6*4μmol/L雷公藤红素组　3　55.6±3.8*5μmol/L雷公藤红素组　3　71.3±5.1*

表2　不同浓度雷公藤红素对T98G细胞的凋亡诱导效应（±s）

表2　不同浓度雷公藤红素对T98G细胞的凋亡诱导效应（±s）

与对照组比较*P＜0.05，与1μmol/L雷公藤红素组比较ΔP＜0.05，与3μmol/L雷公藤红素组比较#P＜0.05

组别　n/孔　zVAD-fmk浓度（μmol/L）灰度比（cleaved caspase-9/β-actin）灰度比（cleaved caspase-3/β-actin）凋亡率（%）对照组　3　0　0.03±0.01　0.02±0.01　2.1±0.3 1μmol/L雷公藤红素组　3　0　0.27±0.04*　0.24±0.03*　10.4±0.9*3μmol/L雷公藤红素组　3　0　0.59±0.04*　0.64±0.04*　22.5±1.7*1μmol/L雷公藤红素+zVAD-fmk组　3　10　0.12±0.02Δ　0.11±0.02*Δ　5.5±0.7Δ3μmol/L雷公藤红素+zVAD-fmk组　3　10　0.19±0.03*#　0.23±0.03*#　9.2±1.3*#

图1　雷公藤红素诱导的T98G细胞凋亡

图2　雷公藤红素激活caspase-9和caspase-3

2.3雷公藤红素通过ROS-JNK/caspase信号通路诱导T98G细胞凋亡进一步研究发现雷公藤红素（3μmol/L）可显著诱导T98G细胞ROS的产生和JNK （c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）的活化。当在T98G细胞培养体系中加入ROS清除剂NAC（N-乙酰半胱氨酸）［4］后，雷公藤红素无法诱导肿瘤细胞凋亡和ROS的产生，并且JNK的活化也同时受到抑制。当在T98G培养体系中加入JNK特异性抑制剂SP600125（SP，也称Anthrapyrazolone）［5］，抑制JNK活性后，雷公藤红素无法诱导细胞凋亡和JNK的活化，但对ROS的产生无影响。

表3　雷公藤红素对T98G细胞ROS-JNK信号通路影响（±s）

表3　雷公藤红素对T98G细胞ROS-JNK信号通路影响（±s）

与对照组比较*P＜0.05，与雷公藤红素组比较△P＜0.05

组别　n/孔　雷公藤红素浓度（μmol/L）NAC浓度（mmol/L）SP浓度（μmol/L）ROS阳性率（%）灰度比（p-JNK/β-actin）凋亡率（%）对照组　3　0　0　0　1.6±0.3　0.05±0.01　2.6±0.3雷公藤红素组　3　3　0　0　36.4±3.7*　0.65±0.05*　25.2±2.1*雷公藤红素+NAC组　3　3　10　0　10.4±1.1*△　0.23±0.03*△　11.4±0.8*△雷公藤红素+SP组　3　3　0　50　35.0±3.9*　0.17±0.02*△　13.1±0.7*△

3　讨论

雷公藤红素是卫矛科植物雷公藤T（ripterygium wilfordii Hook.f）的根或根的木质部提取的三萜类化合物，目前临床上主要用于自身免疫性疾病和神经退行性疾病［6-7］。最近的研究发现雷公藤红素有显著抗肿瘤效应，对多种肿瘤类型都有很好的治疗效果，如肝癌、乳腺癌和肺癌等［8-10］。然而雷公藤红素抗肿瘤的分子机制至今仍不十分清楚，而且其对胶质母细胞瘤是否有治疗作用目前还未有过报道。作者通过体外实验，证实了雷公藤红素能有效抑制胶质母细胞瘤细胞系T98G的细胞活力，并且通过激活caspase-9和caspase-3诱导肿瘤细胞发生凋亡。

活性氧簇ROS是细胞代谢的副产物，少量的ROS有助于促进细胞的增殖和分化，然而过量的ROS能对细胞内的脂类、蛋白质和DNA造成氧化损伤［11-12］。有文献表明，相比于正常细胞，肿瘤细胞往往处于高氧化应激状态，其对ROS浓度的升高更敏感［13］。此外，ROS还可激活下游信号通路（如MAPK通路）诱导细胞发生凋亡。JNK是MAPK蛋白家族的重要成员，与细胞的程序性死亡有关。Krajarng等［14］报道，JNK的激活能显著诱导肿瘤细胞发生凋亡。为了探究雷公藤红素诱导T98G细胞凋亡的分子机制，作者用二氢乙啶染色法检测T98G细胞的ROS水平，并用Western blot实验检测T98G细胞JNK的活化程度，结果发现雷公藤红素能显著诱导胶质母细胞瘤细胞ROS的产生和JNK的活化。当用NAC清除ROS后，雷公藤红素的凋亡诱导效应丧失，而且其对JNK的活化作用也丧失；而当用SP阻断JNK的磷酸化后，雷公藤红素对T98G的凋亡诱导效应也丧失，但对ROS的产生不受影响。上述的这些结果表明雷公藤红素对胶质母细胞瘤细胞凋亡的诱导作用依赖ROS的产生和JNK的活化。

综上所述，本文结果表明雷公藤红素有良好的体外抗神经胶质母细胞瘤的生物活性，其分子机制可能为激活ROS-JNK信号通路诱导人胶质母细胞瘤细胞发生caspase依赖的凋亡。这些实验结果为雷公藤红素治疗肿瘤的临床应用提供了理论依据。

［1］徐佳，伍春莲.雷公藤红素抑制食管癌细胞转移及其机制.生理学报，2015，67（3）:341

［2］许阳贤，宋海燕，季光.雷公藤红素对肝癌细胞SMMC-7721凋亡和周期的调控作用及机制.中成药，2015，37 （6）:1153

［3］Amaral C，Borges M，Teixeira N，et al.Apoptosis and autophagyinbreastcancercellsfollowingexemestane treatment.PLoS One，2012，7（8）:e42398

［4］Raina K，Agarwal C，Agarwal R，et al.Energy deprivation by silibinin in colorectal cancer cells:a double-edged sword targetingbothapoptoticandautophagicmachineries. Autophagy，2013，9（5）:697

［5］Khan MR，Islam MT，Taniguchi T，et al.Muscarinic cholinoceptor-mediated activation of JNK negatively regulates intestinal secretion in mice.J Pharmacol Sci，2015，127（1）:150

［6］Venkatesha SH，Astry B，Moudgil KD，et al.Suppression of autoimmune arthritis by Celastrus-derived Celastrol through modulation of pro-inflammatory chemokines.Bioorg Med Chem，2012，20（17）:5229

［7］Chen S，Gu C，Chen L，et al.Celastrol prevents cadmiuminduced neuronal cell death via targeting JNK and PTENAkt/mTOR network.J Neurochem，2014，128（2）:256

［8］Li PP，He W，Wei W，et al.Celastrol induces mitochondriamediated apoptosis in hepatocellular carcinoma bel-7402 cells.Am J Chin Med，2015，43（1）:137

［9］Mi C，Shi H，Jin X，et al.Celastrol induces the apoptosis of breastcancercellsandinhibitstheirinvasionvia downregulation of MMP-9.Oncol Rep，2014，32（6）:2527

［10］Lo Iacono M，Monica V，Scagliotti GV，et al.ATF2 contributes to cisplatin resistance in non-small cell lung cancer and celastrol induces cisplatin resensitization through inhibition of JNK/ATF2 pathway.Int J Cancer，2015，136 （11）:2598

［11］Anavi S，Ni Z，Fedorova M，et al.Steatosis-induced proteins adducts with lipid peroxidation products and nuclear electrophilic stress in hepatocytes.Redox Biol，2015，4:158

［12］Gupta S，Goswami P，Singh S，et al.6-Hydroxydopamine and lipopolysaccharides induced DNA damage in astrocytes: Involvement of nitric oxide and mitochondria.Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen，2015，778:22

［13］Pelicano H，Carney D，Huang P.ROS stress in cancer cells and therapeutic implications.Drug Resist Updat，2004，7:97

［14］Krajarng A，Imoto M，Watanapokasin R，et al.Apoptosis induction associated with the ER stress response through upregulation of JNK in HeLa cells by gambogic acid.BMC Complement Altern Med，2015，15（1）:544