桧木醇诱导人肾透明细胞癌786-O细胞凋亡及其机制研究*

倪晓辰　赵志红　马永良　任宗涛　刘　彬　樊　博　卫书飞　张爱莉

·基础研究·

桧木醇诱导人肾透明细胞癌786-O细胞凋亡及其机制研究*

倪晓辰赵志红马永良任宗涛刘彬樊博卫书飞张爱莉

目的：探讨桧木醇（hinokitiol）对人肾透明细胞癌786-O细胞株的增殖抑制作用及诱导凋亡效应，初步阐明其机制。方法：采用CCK-8法检测桧木醇对肾癌786-O细胞增殖的抑制作用；流式细胞术检测细胞凋亡情况；转染EGFP-LC3后镜下观察细胞自噬状态；采用Western blot对细胞Caspase-3剪切体、LC3和P62蛋白表达量进行检测。结果：桧木醇可以显著抑制肾癌786-O细胞增殖，通过激活Caspase途径诱导细胞凋亡。桧木醇诱导肾癌786-O细胞发生自噬，LC3蛋白表达显著上调，而P62蛋白表达下调。结论：桧木醇可显著抑制肾癌786-O细胞的增殖并通过过度激活细胞自噬促进肾癌细胞凋亡。

桧木醇肾癌凋亡增殖自噬

Correspondence to:Aili ZHANG,E-mail:z13930409899@163.com

Department of Urology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

This work was supported by the Key Research Project of Medical Science in Hebei Province(No.20110142)

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，在所有恶性肿瘤患者中，肾癌患者约占2%，每年全球新发肾癌患者超过20万例［1］，据估计2014年全美新发肾脏肿瘤患者将会达到63 920例，而死于肾脏肿瘤的患者数量将会达到13 860例［2］。虽然传统的外科手术治疗和近年来兴起的靶向治疗显著提高了肾癌患者的生存率，但肾癌作为人类主要的恶性肿瘤之一仍旧严重威胁着大众健康，需进一步探索更多行之有效的治疗方法。桧木醇（hinokitiol）是从柏科植物提取的一种天然化合物［3］，目前已知桧木醇具有诱导分化、抗真菌和细菌、抗炎、抗氧化等多种生物学活性［4-8］，而最近的研究发现桧木醇也具有显著的抗肿瘤活性，并且该抗肿瘤作用与其导致DNA损伤和凋亡诱导作用有关［9-11］。本研究旨在明确桧木醇的抗肾癌作用并初步探明其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验材料

人肾癌细胞株786-O购自中国科学院细胞库；EGFP-LC3质粒由日本大阪大学Tamotsu Yoshimori教授惠赠；桧木醇购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；CCK-8购自日本东仁化学研究所；Z-VAD-FMK及3-MA购自美国Enzo公司；本研究所使用抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；Lipofectamine 2000为美国Invitrogen公司产品；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。

1.2.2CCK-8细胞增殖实验细胞传代接种于96孔板内，100 μL/孔，待细胞贴壁后依实验所需加入不同浓度药物，培养至相应时间后分别加入10 μL/孔CCK-8，放置于细胞培养箱内孵育，实时观察，酶标仪450 nm比色。

1.2.3Annexin V/PI凋亡检测给予相应药物作用后的细胞常规消化离心，PBS洗涤后，加入500 μL结合缓冲液重悬，分别加入Annexin V和PI各5 μL，混匀后避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡状态。1.2.4Western blot检测收集细胞后裂解，蛋白定量，加入上样缓冲液后煮样变性，SDS-PAGE电泳分离后转膜，一抗封闭过夜，次日二抗室温封闭1 h，ECL化学发光，拍照存档。

1.2.5质粒转染及激光共聚焦显微镜观察细胞传代至激光共聚焦专用平皿内，贴壁后换成无血清无抗生素培养基，使用EGFP-LC3质粒及Lipofectamine 2000制备脂质体-质粒转染复合物，加入细胞内，转染6 h后换液，24 h后观察转染效果，将细胞分为对照组及实验组，对照组给予DMSO，实验组给予相应药物，激光共聚焦显微镜下观察，拍照存档。

1.3统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。数据采用x±s表示，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），组间比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

图1　桧木醇抑制肾癌786-O细胞增殖及诱导细胞凋亡Figure 1　Hinokitiol inhibition on the proliferation of 786-O cells and induction of cell apoptosis

2　结果

2.1桧木醇对肾癌786-O细胞增殖及凋亡的影响

CCK-8细胞增殖实验结果表明，桧木醇处理肾癌786-O细胞24 h后，药物浓度为2.5 μmol/L时，细胞增殖活力受到了明显的抑制（P＜0.01），并且随着给药浓度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）的增加，肿瘤细胞的增殖抑制率也逐渐增加（36.7%、71.8%、87.9%），见图1A。为了更进一步研究桧木醇是否可以诱导肾癌细胞死亡，使用Annexin V/PI流式细胞术检测细胞死亡率（图1B），在给予2.5 μmol/L桧木醇作用肾癌786-O细胞24和48 h后，肾癌细胞死亡率明显上升，Annexin V+/PI-细胞比率分别上升至1.01%和4.94%，Annexin V+/PI+比率分别上升至5.88%和25.4%。Caspase-3是凋亡最终的主要执行者之一，Caspase-3剪切体是Caspase-3的活性形式，其含量的高低可以直接说明细胞的凋亡情况。Western blot检测结果表明，随着给药时间的延长，细胞Caspase-3剪切体蛋白的含量出现了明显的升高（图1C）。Z-VAD-FMK是Caspase蛋白的广谱抑制剂，可以抑制Caspase蛋白的激活，从而抑制凋亡的发生。为了进一步说明桧木醇诱导的细胞凋亡是否和Caspase途径有关，本研究使用了这一抑制剂进行CCK-8实验，结果表明2.5 μmol/L桧木醇作用细胞24 h之后，Z-VAD-FMK可以显著抑制药物对肾癌786-O细胞的凋亡作用（P＜0.01，图1D）。

2.2桧木醇诱导肾癌786-O细胞LC3蛋白酯化及自噬体形成

将EGFP-LC3质粒转染肾癌786-O细胞，待其稳定表达后，给予细胞2.5 μmol/L的桧木醇进行处理，激光共聚焦显微镜下观察，结果显示在给药6 h后，细胞内的绿色荧光点数较对照组明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.01，图2A）。使用Western blot检测肾癌786-O细胞LC3蛋白和自噬特异性底物P62蛋白表达量的变化，结果表明随着给药时间的延长，LC3-II蛋白的表达量明显上升，P62蛋白的表达量明显下降（图2B）。

2.3桧木醇诱导细胞凋亡与自噬的关系

为了更进一步说明桧木醇引起的细胞自噬与凋亡之间的关系，本研究使用了自噬的上游抑制剂3-MA进行实验。CCK-8实验结果表明（图3A），3-MA（2 mmol/L）抑制了细胞自噬活动，24 h可以部分逆转2.5μmol/L桧木醇的抗肿瘤作用（P＜0.01）。流式细胞术结果也提示3-MA（2 mmol/L）24 h可以部分拮抗桧木醇（2.5 μmol/L）对于肾癌细胞的死亡诱导作用（图3B）。使用Western blot进行检测发现在给予3-MA（2 mmol/L）之后，肾癌786-O细胞的LC3-II表达量显著下降，3-MA能够逆转桧木醇导致的LC3-II表达量上升，Caspase-3剪切量表达量也呈现明显的下降趋势（图3C，3D）。

图2　2.5 μmol/L桧木醇于6 h时对肾癌786-O细胞自噬的诱导Figure 2　Hinokitiol（2.5 μmol/L，6 h）induction of autophagy in the 786-O cells

图3　桧木醇诱导细胞自噬对细胞凋亡的作用Figure 3　Effects of hinokitiol induction on cell apoptosis via autophagy

3　讨论

自噬是近年来生命科学及医学领域研究的热点之一。自噬是细胞最基本的生理活动，在维持细胞能量代谢和细胞内环境稳态方面有着重要的作用。自噬泡内的物质被溶酶体所含有的酸性水解酶水解成氨基酸、核酸、糖原和脂肪酸等小分子物质，重新释放至胞质内参与物质的再循环或者为代谢供能［12］。

自噬在肿瘤中的作用异常复杂，目前仍不是十分清楚［13］。在正常生理状态下自噬具有抑制肿瘤发生的作用，机制主要是由于自噬可以清除错误折叠的蛋白、细胞内产生的ROS和受损的线粒体，从而间接维持DNA的完整性和基因组的稳定性。当肿瘤形成后，自噬又促进了肿瘤细胞的存活，自噬可以提供给肿瘤细胞更多的能量，促进肿瘤细胞的生长，赋予了肿瘤细胞在低氧、低营养状态下更强的生存优势［14］。以自噬为靶点的肿瘤治疗已经成为近年来肿瘤治疗研究领域的新热点。

自噬与凋亡之间存在着非常复杂的关系，机制仍旧不明。当自噬过程受到抑制时，细胞由于代谢严重障碍及合成底物严重不足，从而触发细胞凋亡，而当自噬过程过度激活时，细胞内物质由于过度消耗，也可以导致细胞发生凋亡［15］。LC3蛋白是自噬检测的标志蛋白之一，前体LC3蛋白合成之后经过加工修饰形成LC3-I型蛋白，自噬活化时LC3-I酯化形成LC3-II型蛋白，并定位于自噬泡。本研究使用了EGFP-LC3质粒，这一质粒经过转录后表达绿色荧光EGFP-LC3融合蛋白，通过观察绿色荧光可以定位胞内的LC3。低自噬水平状态下，EGFP-LC3在胞质内呈现绿色弥散分布，自噬激活时，EGFP-LC3定位于自噬泡上，呈现明显的点状分布。结果表明桧木醇可以显著增加细胞内自噬泡的数量。Western blot结果发现桧木醇激活细胞自噬的时间（6 h）明显早于凋亡的发生时间（24 h），同时P62蛋白的表达量在给药之后也明显下降。由于P62蛋白是自噬的特异性底物，所以推测桧木醇引起的肾癌786-O细胞凋亡很可能是由于细胞自噬过度激活，导致细胞内物质过度消耗所致。为了进一步解释这一问题，本研究使用自噬抑制剂3-MA进行研究，当给予3-MA从上游抑制细胞自噬之后不仅能够抑制桧木醇的自噬激活作用，还能够部分抑制桧木醇对肿瘤细胞的杀伤作用，这一结果更加说明其作用机制与自噬密切相关。

从天然植物中分离提纯抗肿瘤化合物对于肿瘤的治疗具有广阔的应用前景。桧木醇作为一种天然植物提取物，其抗肿瘤作用研究目前还不够深入，现有的研究发现其具有抗乳腺癌、肺癌和直肠癌的作用［10，11，16］。本研究从体外水平证明了桧木醇的抗肾癌作用，并且发现其诱导肾癌细胞凋亡作用与自噬过程的过度激活有关，进一步丰富了桧木醇的抗肿瘤谱，并初步说明了其作用机制，为该药物的未来开发和临床应用提供了科学依据。

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（2014-08-19收稿）

（2014-12-21修回）

（编辑：张亻 刡）

倪晓辰专业方向为男性泌尿生殖系统肿瘤的转化医学相关研究。

E-mail：nixiaochenhb@163.com

Hinokitiol induces clear cell renal cancer 786-O cell apoptosis via autophagy induction

Xiaochen NI,Zhihong ZHAO,Yongliang MA,Zongtao REN,Bin LIU,Bo FAN,Shufei WEI,Aili ZHANG

Objective:To investigate the effects of hinokitiol on the proliferative inhibition and apoptosis induction in human clear cell renal cancer 786-O cells.Methods:CCK-8 assays were performed to analyze the effects of hinokitiol on the proliferation of 786-O cells.The apoptosis rate was determined by flow cytometry.EGFP-LC3 microscopy assays were performed to assess the autophagy flux.Cleaved Caspase-3,LC3,and P62 were detected by Western blot.Results:Hinokitiol could inhibit the proliferation of the 786-O cells and could induce cell apoptosis via Caspase pathway.Hinokitiol induced the autophagy of 786-O cells,increased LC3 expression,and downregulated P62 expression.Conclusion:Hinokitiol can inhibit the proliferation of 786-O cells and can induce cell apoptosis via autophagy induction.

hinokitiol,renal cancer,apoptosis,proliferation,autophagy

10.3969/j.issn.1000-8179.20141412

河北医科大学第四医院泌尿外科（石家庄市050011）

*本文课题受河北省医学科学研究重点课题计划（编号：20110142）资助

张爱莉z13930409899@163.com