高血脂高胆红素对IE－HPLC法检测糖化血红蛋白干扰的评价＊

萧金丽，张秀明，徐胜男，索明环，徐全中，陈亚琼，吴剑杨，李 曼，阚丽娟，温冬梅

（中山大学附属中山医院检验医学中心，广东中山528403）

2010年美国糖尿病学会（ADA）发布的糖尿病治疗准则中，正式将糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5%作为糖尿病诊断标准，5.7%～6.2%为糖尿病高危人群，≥9.5%为糖尿病并发症的独立危险因素。HbA1c测定作为糖尿病流行病学和监测糖尿病长期治疗效果的重要指标，近年来备受关注［1－2］。因此，在充分肯定HbA1c诊断糖尿病的优越性的同时，客观地阐明HbA1c在实际临床应用中的缺陷同样很有必要，这对于HbA1c更好地应用于临床具有重要的意义［3］。本研究参考美国国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）认证的Ⅰ级实验室的标准，以美国Primus Ultra2糖化血红蛋白分析仪硼酸盐亲和层析高效液相色谱法（AC－HPLC）为对照系统［4－6］，与美 国Bio－Rad VariantⅡ糖化血红蛋白分析仪离子交换高效液相色谱法（IE－HPLC）HbA1c检测结果进行比较分析，探讨高血脂和高胆红素对IE－HPLC的影响。

1 资料与方法

1.1 标本来源 全血标本来源于2012年5月至2013年10月中山市人民医院的住院、门诊患者或健康体检者。收集当天新鲜EDTA－K2抗凝全血标本，－70 ℃保存。将收集的新鲜EDTA－K2抗凝全血标本分成4组：对照组（HbA1c＜6.2%）、糖尿病组（HbA1c≥6.2%）、高血脂组（TG 3～20mmol／L）、高胆红素组（TBIL 21～549μmol／L）［7］。对照组标本来自本院康体保健中心体检的40例健康成年人，无浑浊、无血红蛋白变异体、无高胆红素、无高血脂。糖尿病组标本来源于本院确诊的2型糖尿病患者，无贫血、溶血，无血红蛋白变异体，无高胆红素、高血脂，同时排除尿毒症和慢性肾衰的患者，共40例；糖尿病的诊断标准符合世界卫生组织（WHO）1999年诊断标准。高胆红素组标本来自本院住院或门诊患者，TBIL≥21μmol／L；无贫血、溶血，无血红蛋白变异体，患者无高血脂、尿毒症，共40例。高血脂组来自本院住院、门诊患者或健康体检者，TG≥3mmol／L；无贫血、溶血，无血红蛋白变异体，无高胆红素，患者无尿毒症，共40例。各组标本来源患者的一般资料见表1（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。

1.2 仪器与试剂 美国Primus Ultra2糖化血红蛋白分析仪采用硼酸盐AC－HPLC 检测，美国Bio－Rad VariantⅡ糖化血红蛋白分析仪采用IE－HPLC 检测进行比较分析，采用各检测仪器配套的试剂、校准品、质控品和耗材。

1.3 方法

1.3.1 仪器校准 采用新鲜全血校准的方法，一致性测定数据见文献［8］。参照NGSP能力验证方法，检测健康对照组40份标本，每天检测8份，连续测定5d。

1.3.2 实验方法 参照CLSI EP9－A 文件［9］，实现2个检测系统结果的一致性后，参照相关文献［5－7］，所有检测HbA1c的方法中以硼酸盐AC－HPLC 最不受干扰，故以Primus Ultra2作为对照系统，Bio－Rad VariantⅡ为实验系统，分别检测糖尿病组、高胆红素组和高血脂组标本，每天检测8份，连续测定5d。

1.4 统计学处理

1.4.1 使用Microsoft Excel软件进行统计学分析。参照NGSPⅠ级实验室能力验证可接受标准［10］，对两种检测系统的实验数据进行直线回归分析和偏差（%）分析，实验系统与对照系统差值的95%置信区间（95%CI）差异在参考系统的±0.70范围内以及实验系统与对照系统偏差小于6%作为检测结果可比的2项可接受标准。

1.4.2 使用SPSS17.0软件进行统计学分析。检测结果的组间比较采用配对t检验，采用直线回归相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组的比对 经新鲜全血校准后，对2台仪器进行对照组标本的比对试验。以Primus Ultra2 的测定值为Y，Bio－Rad Variant Ⅱ的测定值为X，直线回归方程为Y ＝0.959 4 X＋0.205 3，r＝0.993，差 异 无 统 计 学 意 义（P ＝0.795）；95%CI：－0.20～0.15，符合在±0.70范围内的标准；偏差（%）为－0.20%～0.30%符合偏差小于6%的标准。见图1、2（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。

2.2 异常组的比对 用2台仪器分别测定糖尿病组、高胆红素组和高血脂组3组标本并作直线回归分析。3组数据的相关系数均大于0.95说明结果分布范围符合要求。当HbA1c≤18.7%时IE－HPLC 检测HbA1c相关系数r＝0.993，95%CI为－0.71～0.89，偏差（%）为－5.8%～6.8%，差异无统计学意义（P ＝0.198）。当HbA1c＜16.3%时IE－HPLC 检 测HbA1c相关系数r＝0.997，95%CI 为－0.31～0.67，偏差（%）为－5.8%～4.3%，差异有统计学意义（P＝0.000），无明显干扰；当HbA1c为16.3%～18.7%时结果出现正偏倚。当TG≤20.78mmol／L时IE－HPLC检测HbA1c结果相关系数r＝0.995；95%CI 为－0.26～0.50；偏差（%）为－5.5%～5.8%；差异有统计学意义（P＝0.000），结果无明显干扰。当TBIL≤549.3μmol／L时，用IE－HPLC检测HbA1c，相关系数r＝0.990；95%CI 为－0.08～0.63；偏差（%）为－14%～4.1%；差异有统计学意义（P＝0.000）。当TBIL≤342.1 μmol／L IE－HPLC检测HbA1c，相关系数r＝0.994；95%CI为－0.09～0.50；偏差（%）为－5.5%～4.1%；结果无明显干扰；当TBIL为380.7～549.3μmol／L 时结果出现负偏倚。见表2及图3～6（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。

表2 Bio－Rad VariantⅡ与Primus Ultra2两系统检测HbA1c的直线回归分析和偏差分析

3 讨 论

2013年国际糖尿病联盟（IDF）公布，中国糖尿病的患病人数为9 840万，居全球首位，同时根据IDF 估计，到2035年中国的糖尿病患病人数将达到1.43 亿。HbA1c作为首选诊断指标，与FBG 和OGTT 相比，检测便捷、可任意时间采血，准确性、可重复性高，是一个宏观的控制指标。在过去的20多年中，HbA1c检测主要用于糖尿病控制、治疗效果评价以及并发症风险评估，从“评估指标”发展到“诊断指标”，体现出HbA1c在临床应用中的优势和价值［4］。但目前我国HbA1c的检测结果一致性现状与临床要求尚存在差距。国内各临床实验室分析仪器种类较多，采用的试剂来源较多，检测性能、试剂规格、分析参数亦各不相同。这些原因使不同实验室间的检测结果存在差异，不具有可比性，给临床应用带来不便［11］。多种因素可影响HbA1c检测，其中疾病状态，如高脂血症、高胆红素血症都会干扰HbA1c检测［4］。并且临床医生在解读HbA1c结果时，HbA1c变化值超过0.5%时医生就有可能改变治疗方案，不准确的结果会造成对患者病情的误判或延误治疗。本研究旨在分析高血脂和高胆红素对HbA1c的检测造成的影响。

IE－HPLC是根据HbA1c与HbA0的等电点不同进行分离。葡萄糖与Hb的β链N 未端Val连接降低了等电点，导致糖化Hb带的正电荷比未糖化Hb的少，与树脂的附着力小，可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将Hb从阳离子交换柱中洗脱下来，再根据每个峰值下的面积来计算HbA1c占总Hb的比例［12］。常规的离子交换HPLC 法经过多年技术上的改进，检测精密度、分辨率及抵抗多种糖化血红蛋白变异体的能力有了明显提高，基本可以达到临床需求，但是还存在众多干扰因素［13］。

本研究表明：人体内的HbA1c＜16.3%时IE－HPLC 检测HbA1c相关系数r＝0.997；95%CI 为－0.31～0.67；偏差（%）为－5.8%～4.3%结果无显著干扰。随着HbA1c浓度增加，正干扰逐渐递增。当TG≤20.78mmol／L 时IE－HPLC 检测HbA1c结果相关系数r＝0.995；95%CI 为－0.26～0.50；偏差（%）为－5.5%～5.8%结果无显著干扰。TBIL≤342.1 μmol／L对IE－HPLC检测HbA1c相关系数r＝0.994；95%CI为－0.09～0.50；偏差（%）为－5.5%～4.1%结果无显著干扰，随着胆红素浓度增加，负干扰逐渐递增，与厂家声明干扰因素及本课题组前期外源性高血脂高胆红素对HbA1c的干扰相一致［14］。

在日常工作中，实验室工作人员面对复杂多样标本，要在短时间内检测出正确结果，需要每个从业者了解每种HbA1c检测原理，能根据患者本身情况选择更合适的检测HbA1c的方法。

［1］王丽娟，纪立农.国际专家委员会关于糖化血红蛋白检测在糖尿病诊断中的作用的报告［J］.中国糖尿病杂志，2009，17（8）：563－568.

［2］陆祖谦，许樟荣.糖化血红蛋白在糖尿病诊断中的作用［J］.中国糖尿病杂志，2009，17（8）：579－582.

［3］李娅，宋宇，段勇.糖化血红蛋白检测的局限性［J］.中华检验医学杂志，2012，35（6）：501－504.

［4］Roberts WL，Frank EL，Moulton L，et al.Effects of nine hemoglobin variants on five glycohemoglobin methods［J］.Clin Chem，2000，46（4）：569－572.

［5］Little RR，Vesper H，Rohlfing CL，et al.Validation by a mass spectrometric reference method of use of boronate affinity chromatography to measure glycohemoglobin in the presence of hemoglobin S and C traits［J］.Clin Chem，2005，51（1）：264－265.

［6］Little RR，Rohlfing CL，Hanson S，et al.Effects of hemoglobin（Hb）E and HbD traits on measurements of glycated Hb（HbA1c）by 23methods［J］.Clin Chem，2008，54（8）：1277－1282.

［7］Holownia P，Bishop E，Newman DJ，et al.Adaptation of latexenhanced assay for percent glycohemoglobin to a Dade Dimension？analyzer［J］.Clin Chem，1997，43（1）：76－84.

［8］温冬梅，张秀明，吴剑杨，等.新鲜全血赋值传递实现不同HbA1c检测系统测定结果的溯源性和可比性［J］.临床检验杂志，2014，32（10）：790－792.

［9］Clinical Laboratory Standard institute.EP9－A2 Method comparison and bias estimation using patient samples［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2002.

［10］Nationnal Glycohemoglobin Standardization Program.NGSP：HbA1cassay interferences［EB／OL］.［2014－11－24］.http：／／www.ngsp.org／interf.asp.

［11］吴炯，邵文琦，周琰，等.上海地区糖化血红蛋白一致性计划建立和结果初步评价［J］.中华检验医学杂志，2012，35（4）：370－372.

［12］宋智心，徐国宾，马怀安，等.糖化血红蛋白测定的标准化现状［J］.中华检验医学杂志，2012，35（6）：497－500.

［13］居漪.糖化血红蛋白检测技术和质量控制［J］.检验医学，2010，25（11）：914－917.

［14］陈颖，温冬梅，张秀明，等.四种方法检测糖化血红蛋白的干扰性能评价［J］.临床检验杂志，2013（10）：786－787.