实时荧光定量PCR 检测CD44v2在膀胱及尿路上皮癌中的表达＊

刘小荣，王永翔，赵立明，赵小东，刘学军，任玉林，李少君

（甘肃省第二人民医院：1.检验科；2.泌尿外科，甘肃兰州730050）

CD44最初被确认为一种淋巴细胞归巢受体和跨膜糖蛋白，一般表达在胚胎干细胞［1］。在淋巴细胞、成纤维细胞和增生的上皮细胞中都可检测到，也可见于肿瘤细胞表面。CD44及其变异体在肿瘤的发生和发展过程中起着重要的作用，与乳腺癌、结肠癌、肾癌、胆管癌、前列腺癌等多种肿瘤的生长、侵袭和转移有密切联系［2－4］。本文应用实时荧光定量PCR 技术检测CD44变异体（CD44v）2蛋白在膀胱及尿路上皮细胞癌中的表达，旨在探讨CD44v2与膀胱及尿路上皮细胞癌发生、发展及复发之间的关系，以及明确其临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院泌尿外科2010年1月至2014年1月膀胱部分切除或全切除手术患者70例。所有患者手术切除标本均经病理证实为膀胱及尿路上皮癌，其中男56例、女14例，年龄29～83岁，平均56 岁。根据国际抗癌协会（UTCC）制定的TNM 分期标准，对上述人群进行膀胱移行细胞癌临床分期如下：Tis～Ta期13例，T1期24例，T2期20例，T3期9例，T4期4例；病理Ⅰ级25例，Ⅱ级23例，Ⅲ级22例；初发组49例，复发组21例；单发组49例，多发组21例。另外，采集正常膀胱黏膜组织标本20例，来自行经耻骨上前列腺摘除术的患者，经病理检查证实为正常膀胱黏膜组织。

1.2 仪器与试剂 API7500实时荧光定量PCR 仪，主要试剂购自北京索奥生物医药科技有限公司，包括核酸提取液B、Taq酶系、CD44v2PCR Mix、CD44v2阳性质控品、阴性质控品。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 取约50mg膀胱黏膜组织转移至1.5mL干净离心管中，加1mL生理盐水混匀，用研磨器研制成匀浆，12 000r／min离心5 min，弃上清液，沉淀加50μL 核酸提取液，充分混匀，100 ℃处理10min，12 000r／min离心5min，取上清4μL做PCR 反应。

1.3.2 PCR 扩增 从试剂盒中取出CD44v2PCR Mix、Taq酶，室温融化并振荡混匀后，10 000r／min离心10s。CD44v2引物序列为，正向：ATC ACC GAC AGC ACA GAC AGA AT；反向：AAC CAT GAA AAC CAA TCC CAG G。测试反应体系配置为：CD44v2PCR Mix 24μL，Taq酶系2μL，然后向各管中分别加入4μL处理后样品或CD44v2阳性定量标准品（使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1 000倍，拷贝数分别为1×106、1×105、1×104copies／mL）或阴性质控品。设置反应体系为30μL，样品名称，标记荧光基团种类（报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA）和循环条件：95 ℃30s，然后95 ℃5s、60 ℃30s共40个循环。

1.4 统计学处理 用SPSS13.0软件，样本阳性率的比较采用χ2检验，P＜0.05为以有统计学意义。

2 结 果

2.1 总体情况 标准曲线r＝0.99，阳性循环阈值（Ct值）为35，基因拷贝数为1×104copies／mL。CD44v2 在正常膀胱及尿路上皮细胞中不表达，在70例膀胱及尿路上皮癌组织标本中有30例为阳性表达，阳性率为42.9%。

2.2 CD44v2表达与膀胱及尿路上皮细胞癌发生、发展及其复发之间的关系 （1）CD44v2表达与TNM 分期的关系：浅表性癌（Tis～T1期）与浸润性癌（T2～T4期）比较，阳性表达率的差异有统计学意义（P＝0.01＜0.05）。（2）CD44v2 表达与世界卫生组织（WHO）病理分级的关系：CD44v2阳性表达率随病理分级增加而升高，高分化膀胱及尿路上皮癌（Ⅰ级）与低分化膀胱及尿路上皮癌（Ⅱ～Ⅲ级）比较，差异有统计学意义（P＝0.04＜0.05）。（3）CD44v2蛋白表达与复发间的关系：初发与复发患者间肿瘤组织CD44v2表达的阳性率比较，差异无统计学意义（P＝0.33＞0.05）。（4）CD44v2蛋白与肿瘤数量的关系：肿瘤单发与多发患者肿瘤组织CD44v2 表达的阳性率比较，差异无统计学意义（P＝0.69＞0.05）。见表1。

表1 CD44v2蛋白表达与TNM 分期、病理分级、复发及肿瘤数的关系（n）

3 讨 论

肿瘤的生长依赖于肿瘤细胞与宿主组织外基质之间的相互作用。CD44是一种蛋白形式的细胞表面黏附因子，参与细胞－细胞、细胞－基质之间的特异性粘连过程［5］。人类CD44基因位于11号染色体短臂（11p13）上，长约92kb，至少有21个外显子，根据编码蛋白的表达方式分为2型：其中10个固定外显子位于基因两端，每端各5个，转录时固定表达，其转录片段存在于所有CD44蛋白中，称为标准型CD44基因（CD44s）；在固定的外显子中间有6～15个外显子仅表达于核RNA 的剪接体中，转录时只存在于一定的CD44转录子中，不固定的表达，称为CD44v基因，主要包括CD44v1～10［6－7］。

CD44s蛋白是存在于多种组织细胞的表面糖蛋白，而CD44v蛋白主要存在于发育成熟阶段的组织器官细胞表面［8］。近年来，国内外学者通过基因水平、蛋白水平两个方面检测尿液中CD44，从而对膀胱肿瘤的分化、浸润、数量、转移、复发及预后作了大量的研究。目前关注较多的主要是CD44s、CD44v2、CD44v6、CD44v8～10对膀胱肿瘤的诊断。CD44s及CD44v的异常表达，与膀胱及尿路上皮癌的发生、发展有着密切的联系，但目前仍未得出统一的结论，多数学者认为CD44s表达缺失同时伴有CD44v表达增高与肿瘤分化程度较差、分期较晚有显著关系［9］，CD44s在膀胱尿路上皮癌中持续表达，但在分化差的浸润性癌中表达下降。但也有研究认为膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱黏膜组织中都有CD44s和CD44v2蛋白的表达，结果是CD44v2 与肿瘤的分级，分期无关，认为CD44v2不能作为诊断膀胱癌的一个指标［10］。而本研究应用实时荧光定量PCR 方法检测了人正常膀胱黏膜及膀胱尿路上皮癌组织中CD44v2蛋白的表达，探讨了CD44v2阳性表达与病理分级、临床分期、肿瘤数量及复发的关系，结果CD44v2蛋白在正常膀胱黏膜上皮无表达，拷贝数小于1×102copies／mL。在70 例膀胱及尿路上皮癌中阳性表达是30 例（42.9%），Ct值均小于35，基因拷贝数均大于1×104copies／mL。CD44v2的表达在不同膀胱及尿路上皮癌TNM 分期和病理分级间有明显差异，CD44v2有助于对膀胱及尿路上皮癌的早期诊断，可作为一个参考指标［11］。

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