测试片法在金黄色葡萄球菌感染快速检测中的应用＊

韩善桥，赵晓航，石 峰，史成和

（中国人民解放军海军总医院基础医学研究中心，北京100048）

金黄色葡萄球菌存在于人体鼻黏膜、皮肤及肠道等部位，是化脓性感染的常见病原菌之一，除引起疖、痈、脓肿等局部感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心内膜炎和脓毒血症等全身感染。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，能产生肠毒素，对肠黏膜损伤性大，所致肠炎起病急，中毒症状重，主要表现为呕吐、发热、腹泻等，因此，金黄色葡萄球菌快速检测对临床及时诊治具有重要意义。分离培养法鉴定金黄色葡萄球菌操作复杂，检测周期长且需细菌检验人员，难以在实验室之外的特殊环境下进行。用测试片法鉴定金黄色葡萄球菌操作简单，结果准确［1－4］。金黄色葡萄球菌测试片现应用于食品卫生的检测，用于临床标本的检测尚未见报道。本研究拟在探讨金黄色葡萄球菌测试片在检测临床标本中的应用情况，为在特殊情况下进行金黄色葡萄球菌感染的快速检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 标准菌株来源 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、藤黄微球菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、福氏志贺菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和嗜水气单胞菌，均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 检测标本来源 检测标本来自临床，包括尿液40份、腹水15份、伤口分泌物20份。

1.3 仪器与耗材 VITEK2Compact全自动微生物分析仪，法国生物梅里埃公司产品。金黄色葡萄球菌测试片购自北京陆桥技术有限责任公司（在有效期内使用）。培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤、脑心浸出液肉汤、布氏肉汤、血琼脂平板、巧克力琼脂平板、胰蛋白胨大豆琼脂和3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂，均购自北京陆桥技术有限责任公司（在有效期内使用）。

1.4 方法

1.4.1 标准菌株复苏 将金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和无乳链球菌等标准菌株按操作说明进行复苏。

1.4.2 测试片定量检测 吸取标本1mL 于无纺布棉垫上，待液体吸收后，轻轻盖上薄膜并将边缘推平，将测试片正面平放于温箱中，35 ℃培养24h，观察结果。

1.4.3 测试片定性检测 揭开测试片薄膜，吸取1 mL 无菌生理盐水于无纺布棉垫上，待液体吸收后，接种待测标本，盖上薄膜并将边缘推平，将测试片正面平放于温箱中，35℃培养24 h，观察细菌生长情况。

1.4.4 测试片灵敏度试验 制备金黄色葡萄球菌新鲜菌液，用无菌生理盐水将菌悬液浓度稀释为10－5、10－6、10－7、10－8和10－9倍，分别吸取不同浓度菌悬液1.0 mL，接种测试片和胰蛋白胨大豆琼脂平板，35 ℃培养24h，观察培养结果。

1.4.5 测试片特异性试验 制备金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和无乳链球菌等26种标准菌株新鲜菌液，用无菌生理盐水稀释成10－5倍菌悬液，分别吸取不同标准菌株菌悬液1.0mL接种测试片，35 ℃培养24h，观察细菌生长情况。

1.4.6 标本接种 根据不同标本选择最佳接种方法，35 ℃培养24h。（1）测试片直接接种标本：对于液体标本（尿液、腹水、脑脊液），直接接种标本1mL；（2）测试片加无菌生理盐水再接种标本：对于拭子取样标本，先将测试片加无菌生理盐水1 mL，再接种标本；（3）标本经倍比稀释再接种：对于定量实验或标本中细菌数多，应将标本作10倍倍比稀释再接种。

1.4.7 测试片最佳培养时间观察试验 将测试片接种金黄色葡萄球菌后，在35 ℃温箱分别培养15、18、24和30h，观察细菌生长情况，选择最佳培养时间。

1.4.8 测试片稳定性试验 将测试片完整包装分别存放在4 ℃冰箱、25 ℃室温和35 ℃孵箱3个不同温度下，每7d检测1次，共检测2次。

1.4.9 细菌鉴定 将临床标本分别接种测试片、血琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂平板，35 ℃培养24h，血琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂平板生长的细菌，使用全自动微生物分析仪鉴定。

1.4.10 测试片结果判定 测试片出现蓝绿色菌落为金黄色葡萄球菌，为阳性结果；测试片为无色或未见蓝绿色菌落为阴性结果。如果尿液中金黄色葡萄球菌数大于或等于104CFU／mL，可诊断泌尿道感染。如伤口分泌物中金黄色葡萄球菌数大于或等于103CFU／mL，表明伤口可能发生细菌感染。对于特殊体液标本（如腹水、脑脊液、关节液），如测试片上有细菌生长，则表明相应部位可能有细菌感染。

2 结 果

2.1 测试片灵敏度试验 金黄色葡萄球菌测试片对其纯菌液检测下限为1CFU／mL，当临床标本中金黄色葡萄球菌为大于或等于1CFU／mL时，测试片即可显示阳性结果，见表1。

表1 金黄色葡萄球菌测试片灵敏度试验结果（CFU／mL）

2.2 测试片特异性试验 在被检测的26种细菌中，除金黄色葡萄球菌呈蓝绿色菌落，表皮葡萄球菌呈黑色菌落外，其余24种非目的菌（粪肠球菌、藤黄微球菌、无乳链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、阪崎肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、产单核细胞李斯特菌、蜡样芽孢杆菌）在测试片上均不生长。

2.3 细菌复活试验 将测试片上的蓝绿色菌落接种到血琼脂平板上，35 ℃培养24h，细菌生长良好。表明测试片上生长的细菌可以保留菌种，进一步做细菌药敏试验及流行病学调查。

2.4 最佳培养时间试验 培养24h 后观察结果比较好，见表2。

表2 不同培养时间金黄色葡萄球菌在测试片上的检出率

2.5 测试片储存稳定性试验 金黄色葡萄球菌均能在培养24h后出结果，与4 ℃存放检测菌落数符合率在92%以上，见表3。

表3 不同存放时间和温度对测试片检测结果的影响

2.6 临床标本检测试验 测试片法与分离培养法的阳性结果一致，见表4。

表4 测试片法与分离培养法检测临床标本结果比较（n）

3 讨 论

传统分离培养法细菌鉴定需要对标本进行培养，待分离出纯菌落后，才能进行细菌鉴定，虽然此方法经典、可靠，但操作复杂、时间长，且需要在有条件的实验室和细菌检验人员才能开展［5－7］。显色培养基是利用细菌产生的特异酶与相应底物（由产色基团和细菌可代谢物质组成）反应而显色，直接观察菌落颜色进行鉴定［8－9］，但仍需配制培养基和高压灭菌，也不适合在野外和舰船上开展。测试片法鉴定细菌是以纸片、无纺布或冷水可凝胶等替代琼脂作为载体，采用选择性培养基和特异性的酶显色剂作为主要原料，制成的一次性细菌快速鉴定产品［10］。它是在分离培养法和显色培养基的基础上发展而来的一项新技术，与分离培养法相比，测试片法克服了分离培养法在细菌培养、分离、鉴定等操作中比较复杂的缺点，只需加样培养24h，直接观察菌落颜色，即可对细菌作出鉴定，不需配制培养基，操作简单，便于携带，检测时间短，非检验人员均可操作，特别适合在舰船远航及野外环境等特殊情况下开展。但细菌测试片法也存在一定不足，如测试片加样后马上盖上薄膜，液体易溢出；测试片种类比较少，只能检测十几种常见细菌；对于一些混合细菌感染的标本，使用一种测试片不能同时检测和鉴定多种病原菌等。

金黄色葡萄球菌测试片具有良好的特异性，在被测定的26种细菌中，除金黄色葡萄球菌呈蓝绿色菌落、表皮葡萄球菌呈黑色菌落外，其余24种非目的菌均不生长。金黄色葡萄球菌测试片灵敏度高，对纯菌的检测灵敏度可达1CFU／mL，对菌落数目在1～9个范围内的菌液，测试片法与平皿法一样均能检测出来。对于一些无菌部位的体液标本，如腹水、脑脊液、关节液等，其检出阳性结果具有一定临床意义。用测试片法与培养法同时检测临床标本75份，其检测结果一致。测试片在短时间使用和运输中，无需采取特殊保存措施。因此，在一些特殊情况下，如野外环境训练、抢险救灾开展医疗服务，舰船远航进行卫勤保障，发生食物中毒后指导突发事件的处理等，金黄色葡萄球菌测试片都具有重要的应用价值。

［1］孙霞，许如苏，卢新.金黄色葡萄球菌测试片的检测性能研究［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（5）：1053－1054，1195.

［2］陈德云，陈国雄，巫结冰，等.测试片法快速检验食品中金黄色葡萄球菌的研究［J］.中国卫生检验杂志，2007，17（8）：1456－1457.

［3］袁丹茅，金建潮，陈前进，等.金黄色葡萄球菌快速检验测试片在食品检验中的应用［J］.中国卫生工程学，2008，7（5）：301－302.

［4］Silva Bo，Caraviello DZ，Rodrigues AC，et al.Evaluation of petrifilm for the isolation of Staphylococcus aureus from milk samples［J］.J Dairy Sci，2005，88（8）：3000－3008.

［5］Davis BD，Dulbecco R，Eisen HN，et al.Microbiology［M］.4th ed.Philadelphia：J.B.Lippincott Company，1990.561－587.

［6］郁庆福.现代卫生微生物学［M］.北京：人民卫生出版社，1995：31－34.

［7］李凡，刘晶星.医学微生物学［M］.7 版.北京：人民卫生出版社，2008：63－67.

［8］杨自副，陈默蕊.定位显色培养基在细菌快速初步鉴定中的应用［J］.国际检验医学杂志，2011，32（7）：760－762.

［9］吴清平，周艳红，蔡芷荷，等.卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（1）：124－126.

［10］吴许文，吴清平，张淑红，等.细菌测试片的冷水可凝凝固剂初步研究和应用［J］.微生物学通报，2009，36（11）：1783－1788.