麦角甾苷眼用固体脂质纳米粒制备及其体外释药的研究*

佟　玲，李志宝，陈　静，刘志东，张　莉，王宝成

麦角甾苷眼用固体脂质纳米粒制备及其体外释药的研究*

佟玲1，2，李志宝3，陈静1，2，刘志东1，2，张莉1，2，王宝成3

（1.天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程中心，天津 300193；2.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津300193；3.通药制药集团股份有限公司，通化134000）

［目的］研究麦角甾苷眼用固体脂质纳米粒的制备方法及其体外释放的情况。［方法］采用乳化蒸发-低温固化法制备麦角甾苷固体脂质纳米粒，超滤离心法测其包封率，并对其粒径、电位、进行进一步考察，用差示扫描量热仪（DSC）表征其性质，采用透析法考察固体脂质纳米粒中麦角甾苷的体外释放行为。［结果］麦角甾苷固体脂质纳米粒的平均粒径为85.56 nm，Zeta电位约为-20.97 mV，药物平均包封率为88.31%，DSC表明其理化性质稳定可靠，体外12 h累计释放率62.46%。［结论］制备的麦角甾苷固体脂质纳米粒包封率较高，粒径小且分布均匀，有良好的缓释作用。

麦角甾苷；固体脂质纳米粒；包封率；稳定性；体外释放

肉苁蓉［Cistanche tubulosa（Scheuk）Whight］为列当科（Orobanchaeceae）植物肉苁蓉干燥带鳞叶肉质茎。主产于内蒙古、青海、新疆等地。主治男子阳痿、女子不孕、血崩、腰膝酸软、血枯便秘等症状。据报道，肉苁蓉具有广泛的免疫调节、抗疲劳、抗氧化、增强体力［1-3］等药理作用。苯乙醇苷类为肉苁蓉的主要有效成份［4］，其中麦角甾苷（Acteoside）为其主要活性成分之一。因麦角甾苷为小分子水溶性成分，半衰期短，易水解，不易透过眼内生物膜屏障等性质导致其生物利用度较低。固体脂质纳米粒（SLN）可提高药物生物利用度，增加其稳定性，具有良好的靶向作用［5］，同时，兼具脂质体和乳剂的能够大规模生产、毒性低等优点，是一种有发展前景的新型给药系统［6-8］。

本实验采用乳化固化法制备麦角甾苷固体脂质纳米粒（麦角甾苷-SLN），对其粒径、电位、包封率进行测定，用差示扫描量热法（DSC）表征其性质，同时考察了其体外释放。

1　仪器与试剂

1.1仪器Nano ZS型激光散射粒径分析仪（Malvern，英国）；TK-20A型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；超滤离心管，透析袋，Milli-Q超纯水系统（Millipore，美国）；XS20S型电子天平（十万分之一，Mettler-Toledo，瑞士）；高速冷冻离心机（J-25 Beckman，美国）。

1.2试剂麦角甾苷（天津中新药业，≥98%）；卵磷脂（Lipoid S-100，上海东尚实业有限公司）；单硬脂酸甘油酯（天津市北方天医化学试剂厂）；聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（Myrj52，南京威尔化工有限公司）；山嵛酸甘油酯ATO888（Gattefosse，法国）；三氯甲烷，乙醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；乙腈，甲醇（色谱纯，天津康科德科技有限公司）。

2　方法与结果

2.1麦角甾苷固体脂质纳米粒的制备称取处方量麦角甾苷、大豆卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、及山嵛酸甘油酯溶于5 mL无水乙醇，加热至75℃作为有机相，另取Myrj52，加入10 mL超纯水，水浴75℃使之溶解作为水相。将有机相缓慢加入600 r/min搅拌的水相中，继续搅拌至有机溶剂挥发至4 mL。经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得麦角甾苷-SLN［9-11］。

2.2麦角甾苷-SLN包封率的测定

2.2.1色谱条件色谱柱为DIKMAODSC18（200mm× 4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1%甲酸水（22∶78），检测波长：330 nm，流速：1 mL/min，柱温：30℃，进样量：10 μL。

2.2.2标准曲线的制备精密称取麦角甾苷适量，用甲醇分别稀释至2.5，5.0，10.0，25.0，35.0，50.0 μg/mL的系列对照品溶液。进样量为10 μL，以峰面积对质量浓度做回归曲线，回归方程为A=16 361C-6 552，R2=0.999 8，结果表明麦角甾苷在2.5～50.0 μg/m范围内线性关系良好。

2.2.3精密度实验取质量浓度为2.5，10.0，50.0 μg/mL的麦角甾苷甲醇溶液，于1 d内测定5次，以计算日内精密度，连续测定3 d，确定日间精密度。结果日内RSD为0.32%，日间RSD分别为0.12%和0.22%，仪器精密度符合要求。

2.2.4过膜回收率测定取浓度7.65，15.3，30.6μg/mL 3种浓度的麦角甾苷溶液2 mL于30 K超滤离心管中，4 000 rpm/min离心20 min后取下层滤液，HPLC测定麦角甾苷质量浓度（C），过膜回收率=C过膜前/ C过膜后。高中低3种麦角甾苷溶液过膜回收率分别为98.62%，97.47%，99.12%。超滤离心管对麦角甾苷无吸附作用，可用来测定麦角甾苷-SLN包封率。

2.2.5麦角甾苷-SLN包封率的测定取0.5 mL麦角甾苷-SLN，加入甲醇稀释至2.5 mL，超声20 min使之破乳，过0.45 μm滤膜，采用HPLC测定其总药物质量浓度（C总）。取0.5 mL麦角甾苷-SLN，加入超纯水稀释至2.5 mL，放入30 K超滤离心管中，4 000 rpm离心20 min后取下层滤液，HPLC测定其游离药物质量浓度（C游离）。计算麦角甾苷-SLN包封率。包封率=（1-C游离/C总）×100%C游离为SLN混悬液中游离药物质量浓度，C总为SLN混悬液药物总的质量浓度。

2.3粒径及Zeta电位测定取最优处方制备的麦角甾苷-SLN混悬液适量，用水稀释10倍，分别测定粒径和Zeta电位［12］。粒径为（85.56±6.16）nm，见图1，Zeta电位为（-20.97±1.30）mA，见图2。

2.4重复性实验按最优处方平行制备3批麦角甾苷-SLN，包封率分别为88.71%，88.56%，87.66%。表明此方法重复性较好。

2.5DSC检测将麦角甾苷标准品，空白纳米粒冻干粉，麦角甾苷-SLN冻干粉和麦角甾苷标准品与空白SLN物理混合物（5∶1）适量分别置于坩埚中。以氮气流20 mL/min、加热速率10℃/min的条件下，从0℃升温到150℃，见图3。

图1　麦角甾苷-SLN粒径图Fig.1　The submicron size of acteoside-SLN

图2　麦角甾苷-SLN Zeta电位图Fig.2　The Zeta potential of acteoside-SLN

结果显示，麦角甾苷在69.92℃有相变峰，空白-SLN在44.77℃出现相变峰。比较麦角甾苷-SLN与物理混合物DSC曲线，物理混合物在45.85℃和67.73℃出现两个相变峰，分别对应空白-SLN和麦角甾苷的相变温度。而麦角甾苷-SLN的DSC曲线中，麦角甾苷单体的相变峰消失，表明麦角甾苷被包裹于纳米粒中。

图3　DSC图谱Fig.3　DSC spectrum

2.6麦角甾苷-SLN体外释放以生理盐水为溶出介质，采用透析法进行测定。精密吸取1.5 mL麦角甾苷-SLN溶液，置于透析袋中，两端封口固定于溶出杯内。取释放介质200 mL加热至37℃，于0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h吸取1 mL释放介质，过0.45 μm滤膜，进HPLC计算其药物累积释放度［13-14］。并同时补充1 mL同温度的介质。结果见图4。结果显示，麦角甾苷溶液组在4 h释放完全，达到平台期，释放率达94.96%。而麦角甾苷-SLN在8 h时释放达到平台期，释放率为57.38%。

3　讨论

药物经角膜渗透与其自身的理化性质有关，具有相对分子质量、分子半径及适宜亲脂性［15］的药物较容易透过角膜。麦角甾苷是水溶性成分，水溶性强，脂溶性较差，因此不易透过角膜。为解决这一问题，本实验将其制备成SLN以增加药物在角膜中的透过量，水溶性较好的药物包封率较低，因此需要选用一种适宜的方法制备麦角甾苷-SLN。SLN的制备方法有很多，主要有高压均质法、热熔分散法、薄膜-超声分散法、乳化-固化法等［16-17］。本实验采用乳化-固化法制备麦角甾苷-SLN，在单因素分析的基础上，以单硬脂酸甘油酯及山嵛酸甘油酯混合物为纳米粒脂质材料，Myrj 52及大豆卵磷脂作为混合表面活性剂。所得的纳米粒粒径、电位、包封率等性质均较好，形态良好、外观澄清透明有乳光存在，且操作简单，重现性好。

图4　麦角甾苷累计释放曲线Fig.4　Accumulation releasing curve of acteoside

包封率是评价纳米粒质量的重要指标，有多种测定方法，如：超速离心法、超滤离心法、凝胶柱层析法等［12，18-20］。实验前期对超速离心法和超滤离心法进行了考察，将制备好的麦角甾苷-SLN置于高速离心机中（转速为14 000 rpm、1 h），离心后上清液中仍然有乳光存在，证明SLN和游离药物并没有完全分离。由于受到仪器的最高转速和时间的限制，无法使纳米粒及游离麦角甾苷完全分离，故放弃此方法。本实验采用超滤离心法，分别对辅料中影响药物包封率的因素进行单因素考察，最终确定优化处方中各个辅料用量。超滤离心法对SLN及游离药物分离完全、效果较好，且重复性好，故采用超滤离心法测定麦角甾苷-SLN的包封率。

麦角甾苷为水溶性药物，因而采用磷酸盐缓冲液（pH5.8、pH6.6、pH7.4）和生理盐水得以保证药物在漏槽状态下进行释放，而稳定性实验结果显示麦角甾苷在生理盐水中12 h稳定，故采用生理盐水作为体外释放介质。研究结果显示，麦角甾苷溶液在释放4 h时释放达到94.96%，内外基本达到平衡。而麦角甾苷固体脂质纳米粒体外释放前8 h时释放较快，释放率达57.38%，随后开始缓慢释放，12 h累计释放率为总药量的62.46%，表明麦角甾苷-SLN缓释性较麦角甾苷溶液组强，有良好的缓释效果。

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（本文编辑：高杉，于春泉）

Preparation of acteoside solid lipid nanoparticle and the in vitro release characteristics

TONG Ling1，2，LI Zhi-bao3，CHEN Jing1，2，LIU Zhi-dong1，2，ZHANG Li1，2，WANG Bao-cheng3
（1.Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Tongyao Pharmaceutical Group Stock Co.，Ltd.，Tonghua 134000，China）

［Objective］To study the preparation of acteoside solid lipid nanoparticle（SLN）and its in vitro release behavior.［Methods］Emulsification-evaporation was appropriate for the preparation of acteoside solid lipid nanoparticle and entrapment efficiency was measured by ultrafiltration.The properties of SLN including mean diameter and Zeta potential were studied.The physical property was measured by DSC and the release property was studied by dialysis method.［Results］Mean diameter and Zeta potential of prepared acteoside solid lipid nanoparticle were 85.56 nm and-20.97 mV.The mean drug entrapment efficiency was 88.31%.The physical property tested by the result of DSC was stability，and the in vitro accumulative release was 62.46%of the total drug.［Conclusion］The acteoside SLN prepared in this study has high encapsulation efficiency and small size which has an even distribution and the in vitro release could be in a well sustained way.

acteoside；solid lipid nanoparticle；entrapment efficiency；stability；in vitro release

R283.1

A

1672-1519（2015）06-0368-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.06.13

教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-12-1068）。

佟玲（1989-），女，硕士研究生，研究方向为中药药剂学。

刘志东，E-mail:lonerliuzd@163.com。

（2014-12-27）