化痰通络方对急性脑梗死大鼠rt-PA溶栓后神经细胞自噬途径中Beclin1与LC3蛋白表达的影响*

张琳琳，周　震，张玉莲，王雪岩，王　坤，王　凯

化痰通络方对急性脑梗死大鼠rt-PA溶栓后神经细胞自噬途径中Beclin1与LC3蛋白表达的影响*

张琳琳1，周震1，张玉莲1，王雪岩2，王坤2，王凯2

（1.天津中医药大学第二附属医院，天津300150；2.天津中医药大学，天津300193）

［目的］观察化痰通络方对急性脑梗死大鼠重组组织纤溶酶原激活剂（rt-PA）溶栓后神经细胞自噬途径中自噬相关蛋白（Beclin1）及微管相关蛋白轻链3（LC3）蛋白表达的影响。［方法］选择160只健康SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、rt-PA组、化痰通络方联合rt-PA组（简称中药组），每组采用6 h、1 d、3 d和7 d 4个时相。采用自身栓子法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO），rt-PA组与中药组分别给予尾静脉注入rt-PA（浓度为5.67 mg/kg）及联合化痰通络中药（浓度为7.2 g/kg）干预，每日2次。于相应时间点采用Western blot检测各组大鼠大脑皮质梗死区组织中Beclin1及LC3蛋白的表达。［结果］Western blot结果显示：与假手术组相比，模型组在4个时相中Beclin1和LC3蛋白的相对丰度值均明显增高（P＜0.05）；采用rt-PA和rt-PA联合化痰通络法干预后，4个时相内Beclin1与LC3蛋白的相对丰度值均明显下降（P＜0.05）；且rt-PA联合化痰通络组下降更加显著，与rt-PA组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。［结论］化痰通络方可通过降低神经细胞自噬途径中Beclin1与LC3蛋白的表达，部分抑制神经细胞的过度自噬，进而保护神经细胞损伤，从而更好的防治急性脑梗死溶栓后缺血再灌注的发生与发展。

化痰通络方；大鼠重组组织纤溶酶原激活剂；溶栓；急性脑梗死；自噬途径；自噬相关蛋白；微管相关蛋白轻链3

急性脑梗死是一种需要快速诊断和治疗的临床急症，超早期溶栓是其最有效的治疗方法之一［1-2］。而溶栓后缺血再灌注损伤直接限制了溶栓疗法的广泛开展，影响了急性脑梗死的临床疗效，目前尚无有效干预手段，其机制与脑部梗死区及周围半暗带区神经细胞的坏死与凋亡有关。针对神经细胞死亡以往大都聚焦于凋亡机制的研究，而近几年，自噬现象成为该领域中的研究热点。研究表明脑缺血损伤中存在着自噬过度激活，最终导致神经细胞自噬性死亡［3-4］，而此过程与自噬相关蛋白（Beclin1）以及微管结合蛋白轻链3（LC3）密切相关［5-6］。

因此本研究观察化痰通络方对急性脑梗死大鼠大脑皮质梗死区Beclin1以及LC3蛋白表达的影响，以期探讨其保护神经细胞损伤的可能作用机制。

1　材料

1.1动物健康SD大鼠160只购自北京大学医学部实验动物科学部 ［许可证号：SZXK（京）2011-00120］，清洁级，雌雄各半，体质量为200～250 g。

1.2药物化痰通络方组成：天麻10g，生半夏10g，丹参30 g，胆南星5 g，地龙10 g，川芎10 g，酒大黄5 g。将上述药物400 g加入10倍水，共煎煮3次，每次30 min，浓缩至500 mL，生药浓度为0.8 g/mL，以上由天津中医药大学第二附属医院制剂室制备，药物于4℃保存备用。注射用重组组织纤溶酶原激活剂（rt-PA），购自德国勃林格殷格翰公司（批号005765201304），血栓诱导剂购自长春国奥药业有限公司（批号20081218）。

1.3试剂与仪器Anti-LC3抗体（Millipore公司，批号MABC176），Anti-Beclin 1抗体（Millipore公司，批号MAB15417），β-Actin（SANTACRUZ，批号sc-47778），T辣根酶标记羊抗鼠IgG（Millipore公司，批号AP136P），Trizol试剂盒（武汉博士德生物工程公司，批号F0231A），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号P0012A），BCA蛋白浓度试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号P0009）等。

2　方法

2.1模型制备血栓制备参照李杰等［7］方法，随后参照张新江、刘健等［8-9］方法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO）。假手术组手术方法同模型制作，只在注射时以生理盐水0.3 mL代替栓子溶液。

2.2动物分组及处理采用随机数字表法将160只大鼠随机分为假手术组、模型组、rt-PA组、化痰通络方联合rt-PA组（之后简称中药组），共4组，每组分为6、24、72 h与7 d共4个时相，每组每个时相选取10只大鼠。给药剂量参照文献［10］中“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算，为7.2 g/kg。中药组与rt-PA组于血栓注入后3 h由尾静脉缓慢一次性注入rt-PA（5.67 mg/kg），中药组联合化痰通络中药灌胃治疗，每日2次，模型组与rt-PA组给予相同时间点等量生理盐水灌胃，于不同时相对大鼠进行2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，取缺血区脑组织以备检测。

2.3观察指标检测Beclin1与LC3蛋白的表达取大鼠梗死区大脑皮质，提总蛋白质，测定蛋白质浓度。对蛋白样品进行SDS—PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，加入一抗孵育，4℃静置过夜。洗涤后加入二抗，孵育，充分洗涤，利用超敏ECL化学发光试剂盒，借助荧光成像仪观察相关蛋白的表达。得到图像结果后应用image J软件计算各组相对丰度值。

灰度比（GSR）=（测得目的蛋白强度×面积）/（内参蛋白β-actin强度×面积）

2.4统计学方法采用SPSS 18.0软件进行统计分析，数据结果均以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LDS法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1不同时相大脑梗死组织Beclin1蛋白的表达结果显示同一组内，和6 h相比，除了假手术组3 d之外，其余各组Beclin1蛋白的相对丰度值均有统计学差异（P＜0.05），但均以1 d时相对丰度值为最高，符合脑梗死发展规律。同一时相内，与假手术组相比，模型组在4个时相中Beclin1蛋白的相对丰度值均明显增高（P＜0.05）；与模型组相比，rt-PA组和rt-PA+化痰通络组在4个时相Beclin1蛋白的相对丰度值均明显下降（P＜0.05）；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在4个时相Beclin1蛋白的相对丰度值均明显下降（P＜0.05），见图1、表1。

图1　不同时相大脑梗死组织Beclin1蛋白的表达Fig.1　The expression of Beclin1 in brain infarction tissue values at different phases in rats

表1　不同时相大脑梗死组织Beclin1蛋白的相对丰度值Tab.1　The relative expression of Beclin1 in brain infarction tissue values at different phases in rats

表1　不同时相大脑梗死组织Beclin1蛋白的相对丰度值Tab.1　The relative expression of Beclin1 in brain infarction tissue values at different phases in rats

注：同一组内和6 h相比，#P＜0.05；同一时相内，和假手术组相比，*P＜0.05；和模型组相比，△P＜0.05；和rt-PA组相比，▲P＜0.05。

组别　1 d　3 d　7 d假手术组　1.03±0.04#　0.94±0.03　0.84±0.05#模型组　1.82±0.21#*1.53±0.07#*　1.33±0.04#* rt-PA组　1.62±0.07#△1.47±0.03#△　1.14±0.03#△n rt-PA+化痰通络组　1.19±0.05#△▲1.01±0.04#△▲0.95±0.02#△▲10 10 10 10 6 h 0.98±0.04 1.60±0.03* 1.32±0.04△1.09±0.03△▲

3.2不同时相大脑梗死组织LC3蛋白的表达结果显示同一组内，和6 h相比，模型组1 d、3 d和7 d，rt-PA组3 d和7 d时LC3蛋白的相对丰度值均有统计学差异（P＜0.05），但均以1 d时相对丰度值为最高，符合脑梗死发展规律。同一时相内，与假手术组相比，模型组在4个时相中LC3蛋白的相对丰度值均明显增高（P＜0.05）；与模型组相比，rt-PA组和rt-PA+化痰通络组在4个时相LC3蛋白的相对丰度值均明显下降（P＜0.05）；与rt-PA组相比，rt-PA+化痰通络组在6 h和1 d两个时相LC3蛋白的相对丰度值均明显下降（P＜0.05），见图2、表2。

图2　不同时相大脑梗死组织LC3蛋白的表达Fig.2　The expression of LC3 in brain infarction tissue values at different phases in rats

4　讨论

自噬是凋亡之外的第2种程序性细胞死亡方式，是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。研究显示自噬可加重脑损伤，在成年大鼠脑缺血模型中，缺血损伤后大量自噬体和自噬溶酶体产生，应用自噬抑制剂可显著减小梗死体积，促进神经功能恢复［11］。此外，观察新生12 d的SD大鼠局灶性脑缺血模型时发现，再灌注起始3 h后注射自噬抑制剂可减小梗死体积37%～46%，而广谱胱天蛋白酶抑制剂却无此作用［12］。故认为脑缺血损伤后主要是通过抑制自噬达到神经保护作用的，在此过程中，LC3与Beclin-1蛋白起关键作用［13］。

表2　不同时相大脑梗死组织LC3蛋白的相对丰度值）Tab.2　The relative expression of LC3 in brain infarction tissue values at different phases in rats

表2　不同时相大脑梗死组织LC3蛋白的相对丰度值）Tab.2　The relative expression of LC3 in brain infarction tissue values at different phases in rats

注：同一组内和6 h相比，#P＜0.05；同一时相内，和假手术组相比，*P＜0.05；和模型组相比，△P＜0.05；和rt-PA组相比，▲P＜0.05。

组别　1 d　3 d　7 d假手术组　1.11±0.14　1.00±0.10　1.05±0.04模型组　2.32±0.08#*1.86±0.04#*1.60±0.19#* rt-PA组　1.83±0.12△　1.49±0.06#△1.42±0.07#△rt-PA+化痰通络组　1.38±0.12△▲1.28±0.10△▲1.39±0.09△n 10 10 10 10 6 h 1.08±0.03 2.16±0.09* 1.79±0.11△1.37±0.16△▲

LC3是酵母Atg8在哺乳动中第一个被鉴别出的类似物，是自噬体形成及胞浆到空泡靶向囊泡必需的蛋白。其定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是细胞自噬泡膜的通用标记物。由于LC3局限在自噬体膜（内膜及外膜）上且LC3的量与自噬体的量呈正相关，现在被广泛地用作监测哺乳动物中的自噬活性和检测自噬体形成的关键分子［14-15］。

Beclin-1是酵母Apg6/Vps30基因的同源物，Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶（PI3K）可与Beclin-1形成复合物参与自噬体的形成［16］。研究指出，Beclin-1-/-小鼠自噬缺陷，细胞凋亡正常，说明Beclin-1是自噬的调控基因［17］。因此，通过免疫印记检测Beclin-1的表达水平，结合其他生化指标，可对细胞的自噬活性进行动态监测和判断。

脑梗死属中医学“中风病”范畴。急性缺血性中风主要病机包括痰瘀互结、酿生浊毒，阻闭脉络、蕴热扰神。其中风、火、痰、瘀、虚是最常见的证候要素，临床上常常以两、三种证候要素相组合为多，急性期则以风、火、痰、瘀为主。国家“十五”科技攻关课题“中风病急性期综合治疗方案研究”（2001BA701A12a）等结果显示，风痰瘀阻证在缺血性中风急性期中占绝对多数［18-19］。根据“急则治其标”的治疗原则，早期投用化痰泻浊、祛瘀通络方药切中病机。笔者在临床对于超早期急性脑梗死风痰瘀阻证患者，采用化痰通络法联合溶栓治疗也取得了满意的疗效，但中药联合溶栓治疗起效的作用机制是什么，是否和抑制自噬过度激活有关，目前尚不清楚。

本研究发现大鼠大脑中动脉栓塞模型梗死组织中LC3和Beclin-1蛋白表达明显增多，验证了脑缺血时存在神经细胞的过度自噬，且1 h时达到峰值，这与脑梗死的发病规律一致。而采用rt-PA和rt-PA联合化痰通络法干预后，4个时相内Beclin1与LC3蛋白的相对丰度值均明显下降，且rt-PA联合化痰通络组下降更加显著，与rt-PA组差异显著。提示化痰通路法联合溶栓疗法可有效治疗超早期急性脑梗死患者，可能与降低大脑梗死区Beclin1与LC3蛋白，抑制神经细胞的过度自噬有关。

自噬是一把双刃剑：一方面过度的自噬可诱导自噬性细胞死亡，并与凋亡信号存在交互作用；另一方面自噬作为自体修复的重要过程，适度激活可能在受损细胞中帮助清除受损的细胞器和异常蛋白、防止蛋白聚集，从而对细胞损伤起保护作用［20］，如何运用好这把双刃剑，使其更好地为临床服务，是今后的工作重点。

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（本文编辑：马英，高杉）

Effects of Huatan Tongluo formulae on expression of Beclin1 and LC3 on gene neuronal autophagy pathway in rat cortex accepted thrombolysis therapy after acute cerebral infarction

ZHANG Lin-lin1，ZHOU Zhen1，ZHANG Yu-lian1，WANG Xue-yan2，WANG Kun2，WANG Kai2
（1.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the effects of Huatan Tongluo formulae on expression of Beclin1 and LC3 on gene neuronal autophagy pathway in rat cortex accepted thrombolysis therapy after the acute cerebral infarction.［Methods］The 160 healthy male SD rats were randomly divided into sham group，model group，rt-PA group，rt-PA-Huatan Tongluo group（Chinese medicine group for short），each group was divided into four time phases:6 hours，1 day，3 days and 7 days.In the corresponding time points prepares the MCAO rat model，the rats in rt-PA group were injected rt-PA（concentration of 5.67 g/kg），and those of Chinese medicine group were given rt-PA and Chinese medicine Huatan Tongluo，2 times a day.Then respectively observe the protein expression of Beclin1 and LC3 by Western Blot.［Results］The results of Western Blot showed:compared with sham group，the expression of Beclin1 and LC3 in model group increased significantly（P＜0.05），compared with model group in the same time phases，the expression of Beclin1 and LC3 decreased in rt-PA group and Chinese medicine group（P＜0.05），especially in Chinese medicine group.［Conclusion］Huatan Tongluo formulae can inhibit the activation of Beclin1 and LC3 on gene neuronal autophagy pathway，and inhibit the nerve cells excessive autophagy at a certain extent，to better prevention and treatment of reperfusion injury after acute cerebra accepted thrombolysis.

Huatan Tongluo formulae；rt-PA；thrombolysis；acute cerebral infarction；autophagy pathway；Beclin1；LC3

R743.33

A

1672-1519（2015）06-0352-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.06.09

国家自然科学基金项目（81273942）；天津市应用基础及前沿技术研究计划（12JZDJC25300）；天津市教委“十二五”创新团队培养计划资助项目（TD12-5035）。

张琳琳（1984-），女，硕士，医师，主要从事中西医结合治疗脑血管病的临床与基础研究。

周震，E-mail：zhouzhen7681@126.com。

（2014-12-28）