荷叶中化学成分的分离与鉴定（Ⅲ）*

夏明辉，彭　双，赵　晶，韩立峰，张　祎，王　涛

·中药研究·

荷叶中化学成分的分离与鉴定（Ⅲ）*

夏明辉1，彭双2，赵晶1，韩立峰1，张祎1，王涛1

（1.天津市中药化学与分析重点实验室，天津300193；2.青海省青海湖药业有限公司，西宁810000）

［目的］研究荷叶中的化学成分，为进一步开发利用荷叶资源提供依据。［方法］采用正相硅胶、反相ODS、SephadexLH-20等柱色谱及制备型高效液相色谱法（HPLC）等方法进行分离纯化，并通过理化性质、质谱、核磁以及文献比对等方法，对化合物的结构进行鉴定。［结果］从荷叶体积分数为70%的乙醇提取物中分离鉴定了6个化合物，分别为：sarmentol F（1）；（3S，5R，6S，7E，9R）－7－megastigmene－3，6，9－triol（2）；（3S，5R，6R，7E）－3，5，6－trihydroxy－7－megastigmen－9－one（3）；3S，5R－dihydroxy－6R，7－mestigmadien－9－one（4）；3S，5R－dihydroxy－6S，7－mestigmadien－9－one（5）；R－（－）－去氢催吐萝芙叶醇（6）。［结论］化合物1～6均为首次从莲属植物中分离得到。

荷叶；化学成分；结构鉴定

荷叶（Nelumbinis Folium）为睡莲科莲属植物莲（NelumbonuciferaGaertn.）的干燥叶。其具有清暑化湿、升发清阳、凉血止血之功效［1］。现代药理研究表明，荷叶具有调脂降脂［2-4］、抗氧化［5］、抗衰老［5］及抑菌［6］等作用。荷叶中主要含有生物碱［7］、黄酮、降倍半萜、木脂素等化学成分，笔者对其化学成分进行了系统研究［8-9］，本文继续报道从该属植物中首次分离得到了6个化合物。它们分别为：sarmentol F（1）；（3S，5R，6S，7E，9R）－7－megastigmene－3，6，9－triol（2）；（3S，5R，6R，7E）－3，5，6－trihydroxy－7－megastigmen－9－one（3）；3S，5R－dihydroxy－6R，7－mestigmadien－9－one（4）；3S，5R－dihydroxy－6S，7－mestigmadien－9－one（5），以及R－（－）－去氢催吐萝芙叶醇（6）。

1　仪器与材料

Agilent 6520系列Q-TOF质谱仪（美国Agilent公司），安捷伦1200制备型高效液相色谱仪（G1361A prep pump，G1365D 1260 MWD，美国Agilent公司），安捷伦1200分析型高效液相色谱仪（G1314A VWD串联Alltech 3300 ELSD，温度：45℃；气流量：1.5 L/min；gain：4；美国Agilent公司），HPLC用分析型色谱柱及制备型色谱柱：安捷伦zorbax C18色谱柱、安捷伦Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm× 21.2 mm，7 μm及 250 mm×4.6 mm，5 μm），Bruker 500 MHz超导核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）。

柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）；ODS（50 μm，日本YMC公司）；Sephadex LH-20（美国GE公司）；薄层色谱硅胶预制板GF254（青岛海洋化工厂）；展开剂：氯仿-甲醇-水（下层，系列体积比例）；薄层显色剂：10%的硫酸乙醇溶液（V/V）；甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚等（分析纯或色谱纯，天津市康科德科技有限公司）、二氯甲烷，氨水（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）、冰乙酸（分析纯，天津市化学试剂三厂）。

所用药材荷叶（Folium Nelumbinis）购自河北安国药材市场，经天津中医药大学张丽娟教授鉴定为睡莲科植物莲（Nelumbo mucifera Gaertn.）的干燥叶。植物标本现保存于中医药研究院。

2　提取与分离

取干燥荷叶药材20 kg，用70%的乙醇水溶液（V/V）加热回流提取两次，合并滤液，减压浓缩回收有机溶剂后，50℃真空干燥，得浸膏约2 394 g，取其中2 280 g，用适量水悬浮后，用4种有机溶剂萃取，分别得石油醚层32 g，二氯甲烷层137 g，乙酸乙酯层77 g和正丁醇层364 g。取二氯甲烷部分（100 g）经硅胶柱层析 ［先用石油醚-乙酸乙酯-氨水10∶1∶0→3∶1∶0→1∶1∶0.002→1∶5∶0.006→1∶10∶0.011（V/V/V）为流动相进行梯度洗脱，然后再用乙酸乙酯、甲醇进行洗脱］，合并得到12组流分（Fr．1－12）。取其中Fr．7（6．0 g），经ODS柱色谱，MeOH－H2O体积比30∶70→40∶60→50∶50→60∶40→100∶0梯度洗脱，合并得到15组流分（Fr．7．1－15）。其中Fr．7．2（277 mg）、Fr．7．7（96．8 mg）经Sephadex LH－20以及制备型高效液相色谱法（HPLC）等手段分离，分别得到化合物6（58mg）和化合物1（13mg）。取Fr．9（5．2 g），经ODS柱色谱，MeOH－H2O体积比30∶70→40∶60→50∶50→60∶40→100∶0梯度洗脱，合并得到14组流分（Fr．9．1－14）。其中Fr．9．3（289 mg）、Fr．9．4（249 mg）、Fr．9．5（448 mg）经Sephadex LH－20及制备HPLC等手段分离，分别得到化合物3（12mg）、化合物4（14mg）、化合物2（31mg）、化合物5（15mg）。化合物1～6结构见图1。

3结构鉴定

化合物1：棕色油状物。TLC板上，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）显色呈棕色。HR-MS给出其准分子离子峰m/z 211.136 8［M-H］-，得出分子式为C13H24O2（Calc.C13H23O2，211.170 4）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）谱的低场区有2组dd峰：δ 5.29（1H，dd，J= 15.5，9.5 Hz，H-7）和5.50（1H，dd，J=15.5，6.5 Hz，H-8），为反式烯氢质子信号；在高场区可观察到四组甲基峰，其中有2个单峰：δ 0.84（3H，s，H-11）和0.88（3H，s，H-12），1个dd峰：δ 1.27（3H，dd.J=6.5，1.5 Hz，H-10），1个d峰：δ 0.82（3H，d，J=7.0 Hz，H-13）；此外，高场区及中低场区还有几组多重峰：δ 1.74（1H，ddd，J=13.0，4.0，2.0 Hz，H-2a）、1.12（1H，m，H-2b）、3.79（1H，m，H-3）、2.10（1H，ddd，J=12.0，6.0，4.0 Hz，H-4a）、0.93（1H，m，H-4b）、1.53（1H，m，H-5）、1.31（1H，m，H-6）、4.30（1H，m，H-9）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）谱中显示有13个碳信号，结合DEPT谱可知化合物1包括1个季碳，2个仲碳，6个叔碳，4个甲基。在低场区只有2个碳信号：δ 130.6和137.3，即为反式双键上的碳信号。中高场区的2个叔碳信号δ 69.0和66.9，从化学位移值可知各连有一个羟基。结合HSQC，知低场区的δ 31.3、23.7、21.4、21.1为4个甲基碳信号。核磁数据（见表1）与参考文献［10］对照后，数据基本一致，确定化合物1为sarmentolF。

化合物2：无定形粉末。TLC板上，体积分数为10%的硫酸乙醇溶液（V/V）显色呈棕色。HR-MS给出其准分子离子峰m/z 251.163 5［M+Na］+，得出分子式为C13H24O3（Calc.C13H24O3Na，251.161 8）。1H-HMR（500 MHz，CD3OD）谱的低场区有2组特征信号：δ 5.72（1H，dd，J=16.0，6.0 Hz，H-8）和5.55（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），知该化合物中有一个反式双键；在高场区可明显观察到4组甲基峰：δ 1.24（3H，d，J=6.5 Hz，H-10）、0.89（3H，s，H-11）、0.98（3H，s，H-12）、0.81（3H，d，J=7.0 Hz，H-13）及几组多重峰：δ 1.93（1H，m，H-5）、1.67（1H，m，H-2a）、1.38（1H，m，H-2b）、1.66（1H，m，H-4a）、1.40（1H，m，H-4b）；在中高场区也有2组明显的多重峰：δ 3.80（1H，m，H-3）和4.29（1H，m，H-9）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）谱中显示有13个碳信号，结合HSQC谱可知该化合物有2个仲碳，5个叔碳、2个季碳和4个甲基。其中δ 135.5（C-8）和133.9（C-7）为反式双键的2个碳信号；而δ 25.9（C-11）、25.2（C-12）、24.2（C-10）和16.5（C-13）则为4个甲基碳信号。核磁数据与参考文献［11］相对照，基本一致（见表1），确定化合物2为（3S，5R，6S，7E，9R）-7-megastigmene-3，6，9-triol。

图1　化合物1～6的结构

化合物3：无色油状物。TLC板上，紫外灯（254nm）下有一暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）显色呈桔红色。HR-MS给出其准分子离子峰m/z 277.121 3［M+ Cl］-，确定其分子式为 C13H22O4（Calc.C13H22O4Cl，277.121 2）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）谱的低场区有2组特征信号：δ 7.29（1H，d，J=16.0 Hz，H-7）和6.37（1H，d，J=16.0Hz，H-8），知为反式双键上的质子信号；在高场区可观察到4组甲基单峰：δ 2.32（3H，s，H-10）、1.28（3H，s，H-11）、0.87（3H，s，H-12）、1.17（3H，s，H-13）；此外，还有几组多重峰：δ 4.18（1H，m，H-3）、1.61（1H，m，H-2）、1.88（1H，ddd，J=13.0，5.0，1.5 Hz，H-4a）、1.78（1H，dd，J=13.0，11.5 Hz，H-4b）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）谱中显示12个碳信号，从HMBC谱中知，有一个碳信号与溶剂峰重叠。结合DEPT谱可知该化合物有4个季碳，2个仲碳，3个叔碳和4个甲基。最低场区的δ 198.0（C-9）为α，β-酮羰基信号；δ 148.7（C-7）和131.2（C-8）为反式双键的2个碳信号：而δ 26.6（C-10）、25.6（C-11）、27.7（C-12）和27.5（C-13）为4个甲基碳信号。上述核磁数据与参考文献［12］相对照，基本一致（见表1），确定化合物3为（3S，5R，6R，7E）－3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物4：无色油状物。TLC板上，紫外灯（254nm）下有一暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（v/v）显色呈棕色。HR-MS给出其准分子离子峰m/z 247.130 7［M+Na］+，推测其分子式为C13H20O3（Calc.C13H20O3Na，247.1305）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）谱的低场区有1个明显的单峰：δ 5.85（1H，s，H-8）；中高场区有1个多重峰，根据峰面积知为1个次甲基质子信号：4.34（1H，m，H-3）；在高场区有4组明显的单峰，均为甲基峰：2.18（3H，s，H-10）、1.43（3H，s，H-11）、1.38（3H，s，H-13）、1.16（3H，s，H-12）和2组亚甲基信号：2.30（1H，d，J=7.0Hz，H-4a）、1.44（1H，m，H-4b）、1.99（1H，d，J=7.0Hz，H-2a）、1.35（1H，m，H-2b）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）谱中共13个碳信号。结合DEPT谱可知该化合物有5个季碳信号，2个仲碳信号，2个叔碳信号以及4个甲基信号。上述核磁数据与参考文献［13］对照，基本一致（见表1），确定化合物4为3S，5R-dihydroxy-6R，7-mestigmadien-9-one。

化合物5：无色油状物。TLC板上，紫外灯（254nm）下有一暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）显色呈淡棕色。HR-MS给出其准分子离子峰m/z 247.132 3［M+ Na］+，推测其分子式为C13H20O3（Calc.C13H20O3Na，247.130 5）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）谱的低场区有1个明显的单峰：δ 5.99（1H，s，H-8）；中高场区有1个多重峰，根据峰面积知为1个次甲基质子信号：4.31（1H，m，H-3）；在高场区有4组单峰，均为甲基峰：2.27（3H，s，H-10）、1.42（3H，s，H-11）、1.39（3H，s，H-13）、1.11（3H，s，H-12）和2组亚甲基信号：2.23（1H，ddd，J=2.0，3.5，13.0 Hz，H-4a）、1.36（1H，m，H-4b）、1.93（1H，ddd，J=2.0，4.0，12.5 Hz，H-2a）、1.35（1H，m，H-2b）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）谱中可见13个碳信号，结合DEPT谱可知有5个季碳，2个仲碳，2个叔碳和4个甲基。碳谱数据与化合物4比较，非常相近，碳谱中除8、9、10相差值分别为0.4、1.2、1.1 ppm之外，其余的差值不超过0.2 ppm，说明化合物5和化合物4为同分异构体。上述核磁数据与参考文献［13-14］相对照，基本一致（见表1），确定化合物5为3S，5R-dihydroxy-6S，7-mestigmadien-9-one。

表1　化合物1～6的碳谱数据

化合物6：棕色油状物。TLC板上，紫外灯（254nm）下有一明显的暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）显色呈黄绿色。HR-MS给出其准分子离子峰m/z 245.115 4［M+Na］+，确定其分子式为C13H18O3（Calc. C13H18O3Na，245.114 8）。1H-NMR（500 Hz，CDCl3）谱的低场区有3组峰，其中2组为d峰：δ 6.85（1H，d，J= 15.5 Hz，H-7）和6.48（1H，d，J=15.5 Hz，H-8）.提示存在一对反式耦合的烯氢；另一组为s峰：δ 5.96（1H，s，H-4），知化合物中还存在一个双键；高场区可观察到4个单峰：δ 2.31（3H，s，H-10）、1.90（3H，s，H-13）、1.11（3H，s，H-11）和1.03（3H，s，H-12），知为甲基信号；中高场区的2组信号δ 2.50（1H，d，J=17.5 Hz，H-2a）和2.34（1H，d，J=17.5 Hz，H-2b）为饱和碳上的同碳耦合质子。13C-NMR（125MHz，CDCl3）谱结合DEPT谱知该化合物有4个季碳，4个伯碳，1个仲碳和4个叔碳。在最低场区观察到有δ 197.8和197.5，知该化合物含2个α，β-酮羰基。低场区的其余4个碳：δ 161.1、145.5、130.4、127.6，为氢谱中所推出的两个双键的碳信号。而高场区的δ 28.3、24.4、23.0、18.8为4个甲基的碳信号。上述核磁数据与参考文献［15］对照，基本一致，确定化合物6为R－（－）－去氢催吐萝芙叶醇［R-（－）-dehydrovomifoliol］。

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Isolation and identification of chemical constituents from Nelumbinis Folium（Ⅲ）

XIA Ming-hui1，PENG Shuang2，ZHAO Jing1，HAN Li-feng1，ZHANG Yi1，WANG Tao1
（1．Key Laboratory of Traditional Chinese Medicinal Chemistry and Analytical Chemistry of Tianjin，Tianjin 300193，China 2.Qinghai Lake Pharmaceutical Company Limited，Xining 810000，China）

［Objective］To investigate the chemical constituents of the lotus leaf for futher research and development.［Methods］The chemical components were obtained by using several chromatographies，such as silica gel，ODS，Sephadex LH-20 and PHPLC，and their structures were identified by the physico-chemical methods，MS，NMR spectra and comparing with literatures.［Results］Six compounds were isolated from 70%ethanol extract of lotus leaves and identified as sarmentol F（1）；（3S，5R，6S，7E，9R）-7-megastigmene-3，6，9-triol（2）；（3S，5R，6R，7E）-3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one（3）；3S，5R-dihydroxy-6R，7-mestigmadien-9-one（4）；3S，5R-dihydroxy-6S，7-mestigmadien-9-one（5），and R-（-）-dehydrovomifoliol（6）.［Conclusion］Compounds 1～6 are obtained from Nelumbo Adans.for the first time.

Nelumbinis Folium；chemical constituents；structure identification

R285.5

A

1673－9043（2015）02－0096-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.08

天津市高等学校科技发展基金一般资助项目（2012 0203）；高等学校博士学科点专项科研基金（20121210110007）。

夏明辉（1990-），女，硕士研究生，主要从事中药药效物质基础研究。

王涛，E-mail:wangt@263.net。

（2014-12-14）