生物节律紊乱影响糖尿病肾病大鼠“气阴亏虚”病机的初步探讨*

陈刚毅，温淑婷，林　育，李雯晴，李铭舜，王俊月，温惠红，宁伟杰

生物节律紊乱影响糖尿病肾病大鼠“气阴亏虚”病机的初步探讨*

陈刚毅1，温淑婷2，林育2，李雯晴2，李铭舜2，王俊月3，温惠红2，宁伟杰2

（1.广州中医药大学第一附属医院，广州510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广州510405；3.广州中医药大学第二临床医学院，广州510405）

［目的］探讨生物节律紊乱对糖尿病肾病大鼠“气阴亏虚”病机的影响。［方法］选用健康SD雄性大鼠64只，随机分为4组，每组16只，分别为:空白组、生物节律紊乱组、糖尿病肾病（DN）组、DN生物节律紊乱组。DN组及DN生物节律紊乱组为小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素（STZ）溶液，高脂饲料喂养建立。复制大鼠糖尿病肾病模型后，生物节律紊乱组、DN生物节律紊乱组同时改变光照诱导为生物节律紊乱模型。实验结束后，观察大鼠饮水量、尿量及体质量变化情况，检测大鼠模型血液中的血糖值、24 h尿蛋白定量及环磷酸腺苷（cAMP）与环磷酸鸟苷（cGMP）的表达水平与比值；大鼠肾脏病理切片苏木精-伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色观察病理改变。［结果］1）与空白组相比，DN组与DN生物节律紊乱组的饮水量、尿量、血糖值、24 h尿蛋白定量明显增多（P＜0.01）；DN组cAMP含量降低（P＜0.05），DN生物节律紊乱组cGMP含量升高（P＜0.05），cAMP/cGMP比值降低（P＜0.01）。2）与DN组相比，DN生物节律紊乱组饮水量、尿量、血糖值明显下降（P＜0.01），24 h尿蛋白定量明显增多（P＜0.01），肾脏病理损害严重；cGMP的含量升高，cAMP与cGMP的比值降低（P＜0.05）。［结论］生物节律紊乱可通过对机体耗气伤阴，促进糖尿病肾病进程。

生物节律紊乱；糖尿病肾病；cAMP/cGMP；气阴亏虚；病机探讨

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的严重并发症，并由此导致终末期肾脏病，目前，中国DN发病率呈上升趋势，成为严重的公共卫生问题［1］。在临床中观察到，DN的证候演变有一定规律。早期以阴虚燥热为主，中期发展为气阴两虚，而晚期则以阴阳两虚为主［2］。其中，气阴两虚是影响DN的发展、转归及预后的重要阶段。针对此阶段进行深入的探究有望揭示DN进展的机制［3-4］。人类历史正处于工业化进程的加速期，随着当今社会压力的增加，人们长期处于熬夜、睡眠不足、昼夜颠倒等不良生活方式，进而打乱人体正常的节律，加速疾病进程［5］。本研究通过观察生物节律紊乱对DN大鼠气阴亏虚的分子环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）表达水平的影响，初步探讨生物节律紊乱促进DN的病机变化。

1　材料与方法

1.1动物清洁级SD雄性大鼠，体质量180～200g，由广州中医药大学医学实验动物中心提供，许可证号：scxk（粤）2013-0092。

1.2主要试剂与仪器链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；大鼠cAMP、cGMP酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（美国R&D公司）；罗氏血糖仪（瑞士罗氏公司）；全自动生化分析仪（日立7170）；离心机Centrifuge5424（德国eppendorf公司）；酶标仪MAX 190（美国SPECTRA公司）。

1.3动物的选择与分组选用健康SD雄性大鼠64只，按随机数字表法随机分为4组，每组16只，分别为：空白组、生物节律紊乱组、DN组、DN生物节律紊乱组，分笼饲养，自由摄食、饮水。

1.4糖尿病肾病大鼠的造模DN组及DN生物节律紊乱组采用小剂量多次腹腔注射40 mg/kg的STZ溶液（STZ溶于pH=4.3的0.1 mmol/L柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液），配合高脂饲料喂养复制糖尿病肾病模型［6］，以连续3次检测血糖＞16.6 mmol/L，24 h尿蛋白排泄＞30 mg为模型复制成功，整个造模周期为8周。

1.5干预措施复制DN大鼠模型后，即实验第9周开始，生物节律紊乱组、DN生物节律紊乱组同时改变光照时间。将两组大鼠置于持续黑暗/持续光照各1周的条件下，经历3次环境颠倒循环共6周。空白组和DN组任置于正常12 h光照/12 h黑暗（光照08∶00～20∶00，黑暗20∶00～08∶00）条件下。

1.6标本采集与指标检测各组动物分别在第1周（实验前）和第14周（实验后）安置于代谢笼中收集24 h尿液，全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白排泄量，同时检测大鼠血液中的血糖值。实验结束，各组大鼠用水合氯醛溶液（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉后，采用大鼠心脏取血法采集血液，EDTA促凝管收集，以3 000 r/min离心5 min，分离血浆。cAMP和cGMP的含量检测采用ELISA法，显色后用酶标仪在450 nm测定光密度（A）值，零孔设为对照，据各孔A值计算待测值的含量。实验结束时切取大鼠肾脏，去掉被膜，用冷生理盐水灌洗以除去肾脏血管内血液，固定于4%多聚甲醛，取少量肾组织常规制片，苏木精-伊红染色法（HE）及过碘酸雪夫（PAS）染色，光镜放大200倍观察肾组织病理变化。

1.7统计方法采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料均以均数±标准差表示。组内自身前后比较采用配对t检验。组间比较时，若符合偏态分布则采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠一般状况空白组小鼠反应正常灵敏，体毛平伏有光泽；生物节律紊乱组小鼠反应较不灵敏，体毛枯萎。DN组在模型成功后出现多饮、多食、多尿症状，活动迟缓，体毛稀疏无光泽；DN生物节律紊乱组在成模后亦同时出现多饮多尿症状，相比于DN组，伴有饮食及尿量的减少，精神异常萎靡，活动明显迟缓，体毛枯萎无光泽，便溏。

去除造模失败和数据不全大鼠后的数据显示，DN组及DN生物节律紊乱组的大鼠的饮水量、尿量较空白组增加，体质量增长缓慢，变化值较空白组减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；同时，DN生物节律紊乱组的饮水量、尿量较DN组减少，体质量呈负增长趋势，有差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2各组大鼠不同时间段血糖测定结果数据显示，实验后的DN组及DN生物节律紊乱组的血糖值均较实验前增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；同时，DN生物节律紊乱组的血糖值较DN组减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表1　各组大鼠饮水量、尿量、体质量变化值的比较

表1　各组大鼠饮水量、尿量、体质量变化值的比较

注：与空白组比较，*P＜0.01；与DN组比较，△P＜0.01。

分组　n饮水量（mL）　尿量（mL）　体质量变化值（g）空白组　11　49.00±18.23　8.33±6.52　77.40±18.92生物节律紊乱组　11　52.31±14.67　8.88±6.14　44.31±28.35* DN组　10 272.00±58.27*　88.80±22.05*　49.80±18.36* DN生物节律紊乱组　6 158.33±51.64*△39.50±28.90*△-24.20±12.24*△

表2　各组大鼠血糖值mmol/L

表2　各组大鼠血糖值mmol/L

注：与本组实验前比较，#P＜0.01；与空白组比较，*P＜0.01；与DN组比较，△P＜0.01。

分组　n　实验前　实验后空白组　11　5.01±0.75　06.07±0.66生物节律紊乱组　11　5.14±0.68　05.99±0.80 DN组　10　5.64±0.93　35.28±7.87*#DN生物节律紊乱组　6　6.32±0.66　17.92±7.08*#△

2.3各组大鼠24 h尿蛋白测定结果数据显示，实验后的DN组及DN生物节律紊乱组的24 h尿蛋白排泄量均较实验前增加，差异有统计学意义（P＜0.01），同时，DN生物节律紊乱组的24 h蛋白尿排泄量较DN组明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表3　各组大鼠24 h尿蛋白排泄量mg

表3　各组大鼠24 h尿蛋白排泄量mg

注：与本组实验前比较，#P＜0.01；与空白组比较，*P＜0.01；与DN组比较，△P＜0.01。

分组　n　实验前　实验后空白组　11　6.90±3.23　11.72±6.91生物节律紊乱组　11　5.77±2.52　13.07±4.18 DN组　8　2.85±0.69　23.71±5.82#* DN生物节律紊乱组　6　4.20±2.16　41.00±8.21#*△

2.4各组大鼠肾脏组织病理形态比较结果显示：空白组肾小球结构及体积正常，肾小球系膜细胞及基质正常无增生；生物节律紊乱组肾小球体积较空白组大，肾小球系膜细胞及基质略有增生；DN组肾小球体积增大，系膜增生明显，系膜细胞增多，肾小管上皮细胞肿胀；DN生物节律紊乱组肾小球体积明显肥大，系膜增生更加明显，系膜细胞明显增多，肾小管上皮细胞较DN组更加肿胀。见图1、图2。

2.5各组大鼠cAMP、cGMP、cAMP/cGMP含量变化

与空白组相比，DN组大鼠cAMP含量降低（P＜0.05）；DN生物节律紊乱组大鼠cGMP含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），cAMP/cGMP比值降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；同时，与DN组相比，DN生物节律紊乱组cAMP升高，cGMP的含量升高，cAMP/cGMP比值降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

图1　各组大鼠肾脏组织病理形态比较（HE染色×200）

图2　各组大鼠肾脏组织病理形态比较（PAS染色×200）

表4　各组大鼠血清环核苷酸含量变化比较

表4　各组大鼠血清环核苷酸含量变化比较

注：与空白组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与DN组比较，△P＜0.05。

分组　n cAMP（nmol/L）cGMP（nmol/L）cAMP/cGMP空白组　11 90.63±10.14　23.20±4.39　3.99±0.62生物节律紊乱组　11 83.80±08.70　24.88±5.07　3.54±0.98 DN组　10 81.36±11.51*23.39±5.48　3.71±1.21 DN生物节律紊乱组　6 97.49±33.34△　38.68±15.75*△2.76±0.94#△

3　讨论

DN目前逐渐成为维持性透析的主要原因，最终引起尿毒症，进行病因病机的探究，是防治DN的基础和关键。DN属于中医“消渴”、“虚劳”病的范畴，其基本病机是本虚标实，阴虚燥热，病变脏腑以肾为主［7］。消渴证候的一般演变规律是，初起常以津伤燥热为主，随着病程的进展，引起阴精亏损，进而出现耗气伤阴，病情日久则演变为阴阳两虚之证［2，8］。

当今激烈的社会竞争使人们的工作和生活在巨大的压力下，越来越多的人生活不规律，从而破坏内在生物节律［9］。生物节律紊乱属于中医病因“起居无节”的范畴，本课题组既往的文献研究结果提示［10］，“起居无节”常表现为昼日过劳，夜不静息，其通过影响人体的气血功能，导致机体脏腑功能受损，促进疾病的发生与发展。在DN的发展中，生物节律紊乱极有可能加重气阴亏虚这一发展进程。

现代生物医学的迅速发展有助于解开“气阴亏虚”的生物学本质。动物实验显示，在糖尿病“气阴亏虚”阶段，大鼠饮食量、尿量比糖尿病初期阶段减少，体质量增长缓慢［11］。1971年，Sutherland EW教授发现cAMP作为细胞内的第二信使调节细胞的生理活动与物质代谢［12］。cAMP、cGMP在细胞代谢及多种生理效应的体现中具有关键的作用。1973年，美国生物学家Goldberg根据cAMP、cGMP这一对环核甘酸对细胞功能的相互对抗、相互制约，保持一定比例关系和相对平衡作用，提出了“阴阳学说与cAMP和cGMP双向调节关系的假说”，认为这可代表“阴阳学说”物质基础［13］。较多研究表明，不论是脾气（阳）虚弱或肾阳衰微，均有cAMP的表达降低，cGMP值高于正常，cAMP/cGMP比值较正常值低［14］。而在阴虚时，主要是cAMP含量升高，不一定伴有cAMP/cGMP比值升高［15］。

光线对生物节律的影响至关重要［16］，本研究通过光暗颠倒改变糖尿病肾病大鼠的外界自然光照环境模拟DN生物节律紊乱模型，发现生物节律紊乱影响DN大鼠饮食量、尿量及体质量的增长，增加DN大鼠肾脏组织病理改变，同时DN生物节律紊乱组的24 h尿蛋白排泄量较DN组上升，由于蛋白尿的多少在一定程度上反应DN的严重程度［17-18］，提示生物节律紊乱可以促进糖尿病肾病“气阴亏虚”进程的发展。DN大鼠的cAMP相较空白组降低，提示在糖尿病肾病后期，“耗气”这一病机更加严重。同时，生物节律紊乱DN大鼠相较DN大鼠的cAMP值升高，cGMP值升高，cAMP/cGMP比值降低，提示在糖尿病肾病进程中，生物节律紊乱将通过“耗气伤阴”这一病机过程加重DN的“气阴亏虚”，进而加重DN恶化及肾脏纤维化。具体引起cAMP/cGMP变化的分子机制值得进一步的探索。

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Preliminary mechanism study of disruption of chronobiological rhythm promoting diabetic nephropathy through“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis:verification in animal experiments

CHEN Gang-yi1，WEN Shu-ting2，LIN Yu2，LI Wen-qing2，LI Ming-shun2，WANG Jun-yue3，WEN Hui-hong2，NING Wei-jie2
（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

［Objective］To observe the effect of“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis in chronobiological rhythm disordered diabetic nephropathy rats.［Methods］Sixty-four Male Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into normal control group，chronobiology disorder group，diabetic nephropathy（DN）group，and DN chronobiology disorder group（n=16 in each group）.DN rats and chronobiology disorder DN rats were injected intraperitoneally with a low dose streptozotocin（STZ）dissolved in saline sodium citrate（SSC）repeatly and fed with high-fat food.After establishing DN models in eight weeks，chronobiology disorder were induced by changing illumination rhythm in chronobiology disorder rats and DN chronobiology disorder rats for six weeks.The drinking volume，urine volume and the change of weight were recorded.The blood glucose，24 h urinary protein excretion，theratio of cAMP and cGMP were measured，then，to observe the pathological changes of the kidney，histology of the kidney sections stained with hematoxylin-eosin and Periodic Acid-Schiff were used.［Results］①Compared with those in control group，the drinking volume，urine volume，blood glucose，24 h urinary protein excretion significantly increased in DN group and DN chronobiology disorder group（P＜0.01），the expression of cAMP decreased in DN group（P＜0.05，the expression of cGMP increased（P＜0.05）and the ratio of cAMP and cGMP significantly decreased（P＜0.01）in DN chronobiology disorder group.②In contrast to the mice in DN group，the drinking volume，urine volume and blood glucose significantly decreased and 24h urinary protein excretion significantly increased（P＜0.01），the results of renal pathological showed developed renal lesions，the expression of cGMP increased and the ratio of cAMP and cGMP decreased（P＜0.05）in DN chronobiology disorder group.［Conclusion］The disruption of chronobiological rhythm may promote diabetic nephropathy through“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis.

disruption of chronobiological rhythm；diabetic nephropathy；the ratio of cAMP and cGMP；deficiency of Qi and Yin；pathogenesis discussion

R587.1

A

1673－9043（2015）02－0091-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.07

广东省大学生创新实验资助项目（1057213003）。

陈刚毅（1975-），男，副主任医师，研究方向为糖尿病肾病临床与基础研究。

温淑婷，E-mail:wsttingzi@163.com。

（2014-11-05）