多指标综合评分法优选柴胡桂枝颗粒提取工艺*

韩忠耀，周福军，刘　芳，侯文彬

多指标综合评分法优选柴胡桂枝颗粒提取工艺*

韩忠耀1，周福军2，刘芳3，侯文彬2

（1.黔南民族医学高等专科学校，都匀558000；2.天津药物研究院，天津300193；3.天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

［目的］正交实验法优选柴胡桂枝颗粒处方药材的提取工艺。［方法］以柴胡皂苷a、芍药苷、黄芩苷及出膏率为检测指标，采用正交实验法优选柴胡等药材的乙醇回流提取工艺。［结果］柴胡桂枝颗粒乙醇回流提取的最佳提取工艺为10倍量80%乙醇提取3次，每次提取2 h。［结论］优选的柴胡桂枝颗粒提取工艺稳定可行，适合于工业化大生产。

柴胡桂枝颗粒；正交实验；提取工艺；柴胡皂苷a；黄芩苷；芍药苷

柴胡桂枝颗粒源于张仲景《伤寒论》所载“柴胡桂枝汤”处方，全方由柴胡、白芍、桂枝、黄芩、党参、半夏、甘草、生姜、大枣组成，其中柴胡、白芍为君药，桂枝、黄芩为臣药，主要用于外感风寒、发热自汗微恶寒的治疗。

现代研究及临床应用证明，柴胡桂枝汤可用于治疗抑郁症［1-5］，疗效确切。方中柴胡、白芍、桂枝、黄芩等8味药的活性成分主要为醇溶性化学成分，而大枣的活性成分呈水溶性，为尽可能地提取和保护方中活性成分，课题组经过前期的工艺筛选、相关文献报道，并根据复方中有效成分的理化性质和药理作用［6-8］，将柴胡、白芍、桂枝、黄芩等8味药进行醇提，同时，醇提后的药渣加上大枣采用水煎煮法提取。经过药效活性筛选，此工艺提取的样品药效较佳。本实验以君药柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍药苷和臣药黄芩中的黄芩苷的提出量及出膏率为综合评价指标，通过单因素实验和正交实验优选柴胡桂枝颗粒的醇提工艺，为该颗粒剂的工业化生产提供依据。

1　材料

柴胡、白芍等药材均购自河北省安国市义通中药材有限公司（批号20130901），经天津药物研究院现代中药研究部周福军副研究员鉴定均为正品。HP1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Luna C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；迪马公司Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Sartorius BP211D型分析天平（德国Sartorius公司）。柴胡皂苷a对照品（南京泽朗医药科技有限公司）、芍药苷对照品（批号110736－200732，购自中国药品生物制品检定所）、黄芩苷对照品（批号110715－200212，购自中国药品生物制品检定所）。其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1评价指标的确定参照文献［9］。方中柴胡、白芍、桂枝、黄芩、半夏、甘草、生姜等8味药的活性成分为醇溶性，采用乙醇提取。醇提部分以君药柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍药苷和臣药黄芩中的黄芩苷的提出量及出膏率为评价指标，采用综合加权评分法［10］优选醇提工艺参数，设定柴胡皂苷a和芍药苷的权重系数均为0.3，黄芩苷和出膏率权重系数均为0.2。

2.2柴胡皂苷a的含量测定

2.2.1色谱条件参照文献［11-12］。Luna C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（30∶70），流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL，检测波长为210 nm。此色谱条件下，柴胡皂苷a与相邻峰的分离度大于1.5，理论塔板数以柴胡皂苷a峰计不低于8 000。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a对照品（五氧化二磷真空干燥24 h）5.06 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备参照文献［13］。精密量取提取液适量，减压浓缩至无醇味，加水调至20 mL溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，每次20 mL。合并正丁醇溶液，再用氨试液充分洗涤3次，每次20 mL。将正丁醇溶液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4线性关系考察精密吸取对照品溶液1、2、4、8、10、20 μL，按2.2.1项下色谱条件进样，以对照品量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y =124.5X+0.181（r=0.999 7），在0.506～10.12 μg范围内线性关系良好。

2.3芍药苷的含量测定

2.3.1色谱条件参照文献［14-15］。Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水（16∶84），流速为1.0 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL，检测波长为230 nm。此色谱条件下，理论塔板数以芍药苷峰计分别不低于5 000。

2.3.2对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品10.32 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。

2.3.3供试品溶液的制备精密吸取提取液适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4线性关系考察精密吸取对照品溶液0.2、0.5、1、2、3、4 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。精密吸取对照品溶液10 μL，按2.3.1项下色谱条件进样，以对照品量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标制标准曲线，得回归方程Y=11 652X+37.28（r=0.999 9），在0.04～0.82 μg范围内线性关系良好。

2.4黄芩苷的含量测定

2.4.1色谱条件参照文献［16-17］。Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.05%磷酸水（50∶50），流速为1.0 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL，检测波长为280 nm。此色谱条件下，理论塔板数以黄芩苷峰计不低于5 000。

2.4.2对照品溶液的制备精密称取黄芩苷对照品10.1 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。

2.4.3供试品溶液的制备精密吸取提取液适量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.4线性关系考察精密吸取对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。精密吸取对照品溶液10 μL，按2.4.1项下色谱条件进样，以对照品量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标制标准曲线，得回归方程Y=36 361X-8.274（r=0.999 9），在0.1～1.0 μg范围内线性关系良好。

2.5出膏率的测定参照文献［18］。精密量取提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴浓缩至干，置105℃烘箱中干燥3 h，取出，于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定其质量，计算干膏收率。

2.6乙醇回流提取工艺优化

2.6.1正交实验设计醇提部分以君药柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍药苷和臣药黄芩中的黄芩苷的提出量及出膏率为评价指标，采用综合加权评分法优选醇提工艺参数，设定柴胡皂苷a和芍药苷的权重系数均为0.3，黄芩苷和出膏率权重系数均为0.2，对乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素进行考察，每个因素选取3个水平。按处方比例称取柴胡、白芍、桂枝、黄芩、党参等药材共9份，每份168 g，加入一定体积分数乙醇，按L9（34）正交表进行实验。因素水平见表1，实验安排及结果见表2，方差分析见表3。

表1　柴胡桂枝颗粒乙醇回流提取工艺正交实验因素水平

2.6.2正交实验结果分析比较各因素的直观分析可知，各因素对醇提工艺的影响的顺序是D＞B＞A＞C，即提取次数＞加醇量＞乙醇体积分数＞提取时间，最佳工艺为：A2B3C2D3，见表2。方差分析结果表明，D、B因素对提取工艺的影响具有统计学差异，见表3。综合提取成本、提取效率等考虑，确定最佳乙醇回流提取工艺为A2B3C2D3，即80%乙醇、10倍量、提取3次，每次2 h。

表2　柴胡桂枝颗粒乙醇回流提取工艺正交实验结果

表3　柴胡桂枝颗粒乙醇回流提取工艺正交实验方差分析

2.7验证实验按处方比例称取药材3份，按优选的工艺条件进行验证，结果见表4。

表4　柴胡桂枝颗粒提取工艺验证结果

3　讨论

随着现代生活节奏不断地加快，人们工作压力增大、精神高度紧张，致使抑郁症的发病率呈逐年上升之势，抑郁症已成为一种严重危害人类身心健康的精神类疾病。据世界卫生组织统计，抑郁症已成为世界第四大疾患，预计到2020年，可能成为仅次于冠心病的第二大疾病。目前，在治疗抑郁症的药物中化学药物疗效明显，但由于化学合成抗抑郁药在长期服用后会出现严重的毒副作用，也存在着抗抑郁谱窄、易复发等缺点，故作用温和、不良反应少的传统中药及其方剂越来越受到人们的关注［19］。中医认为抑郁症多为情志不舒、气机郁滞所致［20］，以肝郁气滞型最多［21］，故以疏肝理气、调节情志为治法，柴胡桂枝方能疏泄肝胆，温振少阳，解郁除烦［22］，临床用于治疗抑郁症取得了满意的疗效，本课题组对该方进行药效筛选，结果也显示对抑郁症有一定疗效。

柴胡、白芍、黄芩单味在不同处方中的的研究工艺很多，但是一般选取1～3个指标［23-25］来评价工艺，本文选取君药柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍药苷和臣药黄芩中的黄芩苷的提出量及出膏率等4个指标，优化提取工艺，注重各指标的协同效应，符合中药复方多靶点多成分起效的特点，较单一指标更全面、科学、客观地对工艺进行了评价。

柴胡桂枝颗粒全方药材提取分为醇提取组与水煎煮组共两组提取，本研究通过正交实验多指标综合评分法深入考察了柴胡桂枝颗粒乙醇回流提取工艺，使有效成分尽可能提取完全，发挥药效。本实验方法具有工艺稳定、操作简便易行、节约生产成本等优点，适合于工业化大生产。

［1］葛鑫宇，于林，蔡俊逸，等.柴胡桂枝汤治疗抑郁症40例临床观察［J］.中国临床研究，2014，27（5）：614-615.

［2］孙学平.柴胡桂枝汤治疗抑郁症临床观察［J］.中医临床研究，2014，6（25）：72-74.

［3］段云飞，张怀亮.张怀亮教授运用柴胡桂枝汤经验［J］.中医药学报，2013，41（2）：81-82.

［4］李怀阔，曲艳津.曲艳津运用柴胡桂枝汤治疗抑郁症经验［J］.长春中医药大学学报，2013，29（4）：221-222.

［5］赵智勇，耿慧春，姚兵，等.柴胡桂枝汤抗抑郁作用的实验研究［J］.中医药信息，2006，23（3）：50-51.

［6］朱永智，陈鸿英，张桂贤，等.白芍与柴胡不同比例配伍白芍总苷及苯甲酸水煎出量的比较［J］.天津中医药，2011，28（1）：78-79.

［7］项亚西，张京红.赤白芍化学成分和药理作用的差异［J］.海峡药学，2010，22（11）：43-44.

［8］赵金娟，刑丽芹，刘金贤，等.指纹图谱技术在黄芩质量控制中的应用［J］.天津中医药，2012，29（5）：516-518.

［9］黄永亮，吴纯洁，何晓燕.中药提取工艺评价指标的研究进展［J］.中药与临床，2012，3（5）：49-52.

［10］刘建海，崔维利，陈涛，等.新生脉散片的提取工艺研究［J］.天津中医药大学学报，2013，32（1）：32-35.

［11］卫昊，刘清，卫伟光，等.HPLC法测定秦岭柴胡及其不同提取物中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d［J］.中成药，2013，35（2）：342-345.

［12］章佳赟，谢晖，潘胜利，等.HPLC测定4种常用柴胡剂中柴胡皂苷a的含量［J］.中成药，2012，32（1）：81-83.

［13］李棣华，刘俊红，伍孝先，等.柴胡微波辅助提取工艺研究［J］.天津中医药，2012，29（3）：289-291.

［14］李雪茹，刘虹，姜佳，等.不同厂家D101大孔树脂对赤芍提取物纯化工艺考察［J］.天津中医药大学学报，2014， 33（1）：49-51.

［15］李向阳，屠万倩，张留记.RP-HPLC法测定不同产地的牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量［J］.中药新药与临床药理，2011，22（5）：563-565.

［16］周礼玲，张师愚.双黄连滴丸质量控制指标黄芩苷的含量测定［J］.天津中医药大学学报，2007，26（4）：202-203.

［17］唐励静，文翔昊，李冲，等.HPLC法同时测定复方金银花颗粒中绿原酸、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩素、芹菜素的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（21）：71-74.

［18］刘雪平，胡君.丹黄消炎膏提取工艺的研究［J］.天津中医药大学学报，2011，30（3）：172-174.

［19］刘佳莉，苑玉和，陈乃宏.抑郁症的治疗研究进展［J］.中国药理学通报2011，27（9）：1193-1196.

［20］程洪燕，武成.81例抑郁症患者中医证候特征的临床调查［J］.天津中医药大学学报，2010，29（3）：129-131.

［21］王燕，陈宏，石秀梅，等.老年抑郁症肝郁气滞型症状相关因素的研究［J］.天津中医药大学学报，2013，32（2）：76-79.

［22］陈建.柴胡桂枝汤临证应用思路浅析［J］.光明中医，2010，25（5）：753-754.

［23］杨爱，霞谢岱，何伟.正交设计优选退热解毒灵颗粒的水提工艺［J］.中国药师，2009，12（10）：1383-1385.

［24］王洛临，施之琪，李智勇，等.黄芩解毒颗粒提取工艺研究［J］.中成药，2012，34（10）：2028-2031.

［25］徐忠坤，郭传宝，殷洪梅，等.正交实验优化羌黄祛痹颗粒处方药材醇提工艺［J］.中草药，2012，43（9）：1764-1766.

Optimization of extraction technology for Chaihu Guizhi granule by multi-index comprehensive evaluation method

HAN Zhong-yao1，ZHOU Fu-jun2，LIU Fang3，HOU Wen-Bin2
（1.Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，China；2.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 3001933，China；3.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To optimize extraction process of prescription drugs from Chaihu Guizhi Granule by orthogonal test.［Methods］Ethanol extraction technology of Radix bupleurl and other herbs was optimized by orthogonal test with Saikosaponin A，baicalin，paeoniflorin and extract rate as detection index.［Results］Optimum extraction process conditions were determined as follows:Radix bupleurl and other herbs were extracted 3 times with 2 h by 10 times the amount of 80%ethanol.［Conclusion］This optimized extraction technology of Chaihu Guizhi Granule was stable and feasible，it could be extended to industrial production.

Chaihu Guizhi granule；orthogonal test；extraction technology；Saikosaponin A；baicalin；paeoniflorin

R284.2

A

1673－9043（2015）02－0108-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.11

国家“十二五”重大新药创制专项课题（2014ZX09 101021）。

韩忠耀（1981-），男，硕士，主管药师，主要从事中药质量控制研究。

侯文彬，E-mail:houwb@tjipr.com。

（2014-11-23）