大黄鱼serC基因的克隆、鉴定以及信息学分析

刘　浩，黄　伟

（1.浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山　316022；2.国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山　316022）

综述

大黄鱼serC基因的克隆、鉴定以及信息学分析

刘浩1，黄伟2

（1.浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山316022；2.国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山316022）

磷酸丝氨酸转氨酶1（serC）是生物L-丝氨酸合成途径中的关键酶，能够直接催化3-磷酸丝氨酸的合成，以影响多种前体物质的合成代谢，目前该基因在海洋鱼类中的研究未见报道。本研究通过对大黄鱼全基因组数据库的比对与分析，鉴定并克隆了大黄鱼serC基因，测序验证其全长。该基因cDNA全长1 581 bp，其中开放阅读框1 263 bp，共编码420个氨基酸。将大黄鱼的serC基因氨基酸序列与其它物种进行多重序列比对，结果发现大黄鱼的serC氨基酸序列比较保守。系统发育树表明大黄鱼serC基因与三刺鱼的亲缘关系最为接近。大黄鱼serC基因的组织差异表达分析采用半定量PCR技术，结果表明serC基因在大黄鱼肝脏组织中表达量最高，在脑与鳍组织中表达较高，其余组织中表达量都比较低。本研究分析了大黄鱼serC基因的表达特征与进化地位，为serC基因家族的进一步研究提供了基础资料。

大黄鱼；serC基因；克隆；分子特征；生物信息学

大黄鱼Pseudosciaena crocea肉质鲜嫩、营养丰富，曾是我国东海“四大海产”之一［1］，但自上世纪70年代，由于过度捕捞和海域环境破坏导致群体数量急剧下降，资源几近枯竭［2］。后人工养殖大黄鱼获得成功，养殖规模也逐年扩大，但在养殖过程中出现大黄鱼性成熟提前、生长率下降等问题。为了解决这些问题，水产研究者从能量代谢、营养调节［12］、相关基因定位［2］等不同角度对大黄鱼生长发育的调控机制进行了研究。氨基酸合成与代谢是鱼类营养吸收与代谢的重要组成部分［12］，为鱼类正常生长发育提供保证。其中L-丝氨酸作为一种中间代谢产物与前体产物对大黄鱼生长速率与性别分化有着重要意义。

L-丝氨酸是一种非必须氨基酸，参与生物体内多种重要的代谢通路，包括甘氨酸、L-半胱氨酸、神经递质d-丝氨酸等物质的生物合成［3-4］，是多种氨基酸合成的原料与前体产物。同时L-丝氨酸与生物大脑发育、神经功能［5］等有密切联系，而且这种联系贯穿于生物的出生存活、生长、发育［7-9］。且L-丝氨酸广泛应用于药品、食品和化妆品等多种工业当中。在L-丝氨酸合成过程中的产生的中间产物与衍生物对疾病治疗、人体生理技能调节［10］等都有积极作用。

在动物体内，L-丝氨酸是在细胞质中由磷酸氨基转移酶1（phosphoserine aminotransferase 1，serC）催化合成［3-4］，是磷酸丝氨酸生物合成通路的第二步反应［14］，serC基因是L-丝氨酸合成通路中的调控点和关键酶，对于探究L-丝氨酸的合成情况有积极作用。serC基因已经在多个物种被鉴定与分离，包括细菌［15-17］、酵母［18］、植物［19-21］和动物［22-23］当中，但有关鱼类serC基因的鉴定与分离仍未见报道。本文以大黄鱼为材料，克隆了serC基因cDNA全长、进行了基因结构分析、进化树构建、组织差异性表达以及在不同组织中表达水平的变化分析，为阐明大黄鱼氨基酸代谢通路提供了基础资料。

1　材料与方法

1.1材料

2013年6月捕获东极大黄鱼养殖基地内获得雄性大黄鱼3尾，体重约500 g/尾。各取其脑、性腺、肝脏、脾脏、心脏、胃、肌肉、鳍组织样品约2 g保存于RNA保存液（上海生工有限公司）中备用，用于提取总RNA。

1.2总RNA的提取与cDNA的合成

将上述样品转移至Trizol（Invitrogen公司）溶液中，按照SV Total RNA Isolation Kit（Promega公司）试剂盒说明书所述步骤提取各个样品总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。提取的各组织总RNA用Powerscrit reverse transcriptase Kit（Clontech公司）试剂盒反转录得到第一链cDNA。

1.3RT-PCR

本实验室测定了大黄鱼全基因组，并组建了本地数据库，根据本地数据库中基因注释信息，获得serC基因序列信息设计上下游引物serC-F和serC-R，引物信息详见表1。序列以cDNA为模板进行扩增，总体系为20 μL。扩增调节：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，共执行28个循环，72℃延伸10 min，反应结束。

表1　PCR引物序列Tab.1　Nucleotide sequences of primers used for PCR

1.4PCR产物的回收与测序

使用2%的琼脂糖电泳回收PCR产物，连接至克隆载体pMD-18T（Takara公司），转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞进行扩大培养，提取质粒（试剂盒购自Omega公司）后进行测序（上海生工有限公司）。

1.5序列分析

利用软件DNAman对测序结果进行分析，确认大黄鱼serC基因的全长cDNA序列。在NCBI上利用在线序列保守区域预测工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）对大黄鱼serC基因进行预测。利用SMS网站（http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）将核苷酸序列翻译成氨基酸序列并预测了蛋白质的分子量大小与等电点。使用SignalP 3.0在线服务器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）检测蛋白的信号肽序列。利用亚细胞定位和转膜结构服务器预测了蛋白的亚细胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/）与转膜结构（http：//antheprot-pbil.ibcp.fr/）。利用Clustal X软件将该氨基酸序列与部分其他物种的serC蛋白氨基酸序列进行同源对比，系统进化树由MEGA 4.0软件构建，使用的构建方法是邻位法（NJ，Neighbor-Joining）。

1.6半定量PCR

使用半定量PCR的方法粗略检测serC基因在大黄鱼各组织中的表达情况，根据cDNA序列设计引物Semi-F和Semi-R（表1），PCR产物长度为750 bp。PCR扩增条件：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s；56℃退火45 s；72℃延伸45 s，共执行28个循环，72℃最终延伸10 min，反应结束。使用1.5%琼脂糖凝胶检测半定量PCR结果。

2　结果

图1　A：大黄鱼serC基因编码区氨基酸序列全长与cDNA序列全长B：serC基因氨基酸序列保守区域预测Fig.1　A：The amino acid and cDNA sequences of serC gene from Pseudosciaena crocea.B：Conserved domain prediction of serC gene determined by NCBI.（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）

2.1大黄鱼serC基因cDNA全长与序列分析

对PCR扩增（引物为SerCF、SerC-R）获得的产物进行测序，结果确认长为1 581 bp的片段，包括27 bp的5′非翻译区（5′UTR）和291 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与大黄鱼基因组测序结果一致。图1为serC基因全长与保守区域预测。

该基因开放阅读框（ORF）长度为1 263 bp，编码420个氨基酸。预测的其分子量大小为46.61 kD，恰好在40～48 kD之间［11，27］，符合前人的研究结果，其等电点为6.85。序列保守区域预测显示serC基因包含有一个磷酸吡哆醛结合位点，该位点是serC基因家族的特征，也证明了从大黄鱼中克隆出来的序列属于天冬氨酸转氨酶超家族［28］。利用在线Signal软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）对其编码区氨基酸序列进行分析，没有发现信号肽。说明serC基因编码的蛋白属于非分泌型蛋白。跨膜蛋白分析（http：//antheprot-pbil.ibcp.fr/）显示该蛋白在第296到301个氨基酸之间存在着跨膜结构域，构成跨膜结构域的氨基酸分别是半胱氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和异亮氨酸。蛋白亚细胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）证明该蛋白在线粒体发挥作用（Loc：M Reliability class：5）。

图2　SerC基因的结构组成分析Fig.2　Structure comparison and analysis of serC gene

在对研究了多个物种的serC基因结构后，结果见图2。结果显示大多数物种的serC基因尤其是硬骨鱼类，其CDS都是由8个外显子组成，而且其中三个外显子都是位于基因组序列的4～7 kb之间，且具有相似的长度与几乎相同的排列结构，这说明了serC基因家族在进化历程中相当保守。笔者还发现磷酸吡哆醛连接位点作用于底物的特定氨基酸残基、NCBI预测的保守区域都是普遍定位于此三个外显子序列中。这证明了这三个外显子拥有较高的酶活，是serC基因的催化位点和关键区域。

图3　serC基因系统进化树Fig.3　Phylogenetic tree analysis of serC gene

在NCBI上将编码区氨基酸序列进行BLAST比对，发现其与斑马宫丽鱼Maylandia zebra的serC序列有91%的一致性，与人Homo sapiens的序列一致性仅为73%。从NCBI蛋白数据库中选取具有代表性的各类物种27种，包括细菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物，将细菌M.tuberculosis设为外群，用MEGA 4.0软件构建系统进化树，采用的是NJ（Neighbor-Joining）法，设置重复次数10 000次（bootstrap test 10 000 replications），结果见图3。从进化树的结果来看，大黄鱼在进化关系上与三刺鱼G.aculeatus最为接近，聚为一支。而且鲈形目的三种硬骨鱼类自行聚成了一支，分别是大黄鱼P.crocea、罗非鱼O.niloticus和斑马宫丽鱼。同样鲀形目也自行聚成了一支，分别是红鳍东方鲀T.rubripes和斑点绿河豚T.nigroviridis。进化树结果能够将物种以脊椎动物、非脊椎动物、植物、细菌与真菌分成5类，与经典分类学有相似的结构，其可信度较高。

2.2serC基因在大黄鱼不同组织中的表达差异分析

半定量PCR的结果见图4，结果显示serC基因在大黄鱼的肝脏（第三组）中有较强的表达，在心脏（第五组）和肌肉（第七组）中没有表达，在大脑（第一组）和鳍（第八组）组织中表达量比较高。serC基因在肝脏中的高表达可能与肝脏中丰富的转氨酶系和氨基酸合成通路有关。

图4　半定量检测serC基因在不同组织中的相对表达水平Fig.4　Relative expression of serC gene in various tissues in P.crocea by semi-RT PCR

3　讨论

目前对于serC基因的研究多见于哺乳动物和昆虫等，在鱼类方面对此基因知之甚少。serC是L-丝氨酸合成的关键酶，serC基因活性是生物体内氨基酸合成通路的一个重要作用因子。serC基因编码的蛋白质是由两个亚基组成，每个亚基都是由一个大的磷酸吡哆醛连接区域和一个比较小的区域包括碳端的末尾部分和氮端的一小部分［14］。本研究通过分子克隆技术得到了大黄鱼serC基因全长cDNA序列，其开放阅读框所推导的氨基酸序列与脊椎动物有75%～91%的序列一致性；与无脊椎动物有61%～72%的序列一致性；和植物有大约53%的序列一致性；与细菌有48%的序列一致性；与真菌只有45%的序列一致性，这说明了serC基因家族编码的蛋白有比较高的相似度，即该基因在漫长的进化历史中是比较保守的，这也显示了serC基因和氨基酸代谢对于生物存活的重要性。对其功能结构位点进行解析，发现（图5）在序列极端保守区域存在着磷酸吡哆醛结合区域（双下划线部分）。这种基序是serC基因家族的保守区域和重要功能作用位点，是其活性所必须的多肽位点［29］。这也说明了本次克隆得到的序列确是属于天冬氨酸转氨酶超家族。有研究［29-31］表明，第195号赖氨酸是吡哆醛磷酸化的关键结合氨基酸，可以结合底物催化反应进行。195号赖氨酸所处的区域也是serC基因最保守的区域之一。多重序列比对中值得注意的是大黄鱼serC基因在碳端比其他物种的serC基因多了55个氨基酸（图5左上方框），而且在serC基因一处比较保守处（图5右上方框），大黄鱼却缺失了这一段氨基酸序列。推测可能在大黄鱼演化过程中经历过独特进化事件，尚待进一步研究。

图5　大黄鱼serC基因的氨基酸序列与相关物种的serC基因多重比对Fig.5　SerC amino acid multiple alignment between P.crocea and other species

L-丝氨酸因参与多种神经、大脑发育分化调控，生长速率调节，逐渐引起研究者的兴趣，在催化合成L-丝氨酸的过程中，serC基因催化3-磷酸羟基丙酮酸至L-磷酸丝氨酸的可逆反应，是催化L-丝氨酸合成初始步骤的关键酶。对鱼类的许多生理过程特别是生长速率具有重要调节作用。在本研究中发现serC基因在肝脏中表达量较高，在其他组织中表达量比较低，说明serC基因的主要生理功能就是在肝脏中催化各类转氨基反应（包括丝氨酸转氨基），证明了肝脏是主要的转氨基反应的发生器官。

本研究成功获得了大黄鱼serC基因的全长cDNA序列，通过分析其在各组织中的表达水平、基因结构、来探究该基因的表达模式。构建了serC基因的进化树，分析了其在进化中的特点和地位，为以后深入研究此家族基因打下了一定基础。

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Identification and Characterization of A Phosphoserine Aminotransferase 1 cDNA in Pseudosciaena crocea

LIU Hao1，HUANG Wei2
（1.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University Zhoushan316022；2.China National Engineering Research Center for Marine Aquaculture，Zhoushan316022，China）

Phosphoserine aminotransferase 1 is a key enzyme in synthesing L-serine.This enzyme has great influence on metabolism of many precussor substances by catalyze 3-phosphoserine，which has not been reported in marine teleost.In this study，a phosphoserine aminotransferase 1（serC）gene from large yellow croaker（Pseudosciaena crocea）was isolated and characterized by searching and aligning the whole genome database of P.crocea.The overall cDNA length is 1 581 bp，containing an open reading frame of 1 263 bp，encoding 420 amino acids.According to the multiple alignment analysis，the amino acids sequence of serC was relatively conserved.Phylogenetic tree is built to show the genetic distance of serC with other species.The result showed serC from P.crocea is most genetically closed to Gasterosteus aculeatus with a 91.46% similarity.RT-PCR was conducted to check serC in tissue expression.The result showed the most abundant serC expression is in liver，and brain and fin tissue have high expression.In this study serC gene of P.croceawas identified and characterized，which might contribute to the further research on the serC family genes.

Pseudosciaena crocea；phosphoserine aminotransferase 1；gene clone；chracterization；bioinformatics

S917.4

A

1008-830X（2015）03-0209-07

2015-02-20

科技部国际科技合作港澳台项目（2014DFT30120）

刘浩（1989-），男，浙江舟山人，硕士研究生，研究方向：鱼类功能基因.E-mail：lh_zccnmjb@163.com

黄伟（1978-），男，湖北武汉人.E-mail：huangwei@zjou.edu.com