血清含量对HaCaT细胞生长特性及迁移能力的影响*

张泽曦，李墨灵，杜天乐，夏庆梅，张　晗

·学生园地·

血清含量对HaCaT细胞生长特性及迁移能力的影响*

张泽曦，李墨灵，杜天乐，夏庆梅，张晗

（天津中医药大学，天津300193）

［目的］考察不同血清含量以及培养不同时间对人永生化角质形成细胞（HaCaT）细胞的生长及迁移特性的影响，为HaCaT细胞划痕实验条件优化提供实验数据支撑。［方法］培养HaCaT细胞，按10%血清浓度全培基（全培基阳性对照组）、2%低浓度血清培基（低血清培基组）及无血清培基（对照组）分组，通过进行细胞划痕实验，CCK-8细胞活力检测、Brdu细胞增殖实验，分析HaCaT生长特性。［结果］在24 h内，低血清培基组HaCaT细胞与全培基组相比，细胞增殖能力无明显差异，细胞活力有增高的趋势。细胞孵育48 h后，全培基组细胞增殖能力及活力明显升高。24～48 h，全培基组细胞增殖能力及细胞活力的提升速度明显高于低血清培基组。［结论］培养基中血清含量对HaCaT细胞生长特性及迁移能力具有重要影响，培养24 h内低血清培养条件有利于划痕实验的观察与测定。

HaCaT细胞；划痕实验；创伤修复；方案优化

角质形成细胞是人表皮的两大类主要组成细胞之一。人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）是由成人表皮细胞自发转化而来的细胞系，具有永生性，并与角质形成细胞具有相似的增殖、分化特性，遗传特性稳定［1］，是现代生物医学实验中常使用的一种细胞系。国内外学者常将该细胞系应用于治疗各类皮肤病的药物实验研究中，包括皮肤修复愈合、银屑病、防晒等研究［2-3］。创伤修复是一个涉及表皮角质形成细胞、成纤维细胞等多种类型细胞间相互作用以及多个病理生理反应机制的复杂过程［4-5］。因此，很多人也将HaCaT细胞应用于有关皮肤烧伤后创伤修复的研究：研究促进创面修复的因素［6］，HaCaT细胞过度增殖而引起的创伤后创面过再生的问题［7］，以及利用HaCaT细胞为种子细胞构建新型人组织工程皮肤［8］。

细胞划痕实验是一种操作简单的研究细胞迁移的体外实验方法，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，是研究创伤愈合的常用检测方法之一［9-10］。创伤愈合是细胞迁移和增殖共同作用的结果，在实际细胞划痕实验中，研究者为观察药物对细胞迁移的作用，常采用低血清培养条件，以降低细胞增殖能力，减少血清对药物作用的干扰。应用人永生化角质形成细胞HaCaT进行划痕实验研究发现，在2%低血清培基孵育细胞24 h后与全培基组相比划痕损伤愈合趋势更为明显，继续培养24 h后，全培基组划痕愈合率明显高于低血清培基组。在此基础上，通过培养HaCaT细胞，进行CCK-8细胞活力检测、Brdu增殖实验，考察不同血清含量以及培养不同时间对HaCaT细胞的生长及迁移特性影响，为HaCaT细胞划痕实验条件优化提供实验数据支撑，现将对此研究报道如下。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞人永生化角质形成细胞（HaCaT），购自北京协和细胞库。

1.1.3细胞培养试剂与检测试剂 MEM/eb（sHyClone）、胎牛血清（BI）、双抗（HyClone青霉素+链霉素，青霉素10 000 U/mL，链霉素10 000 μg/mL）、胰酶（0.25%胰蛋白酶+0.125%EDTA、BI）、BrdU试剂（罗氏）、CCK-8检测试剂盒（Dojindo）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与分组HaCaT细胞以2×105cells/cm2接种于25 cm2的培养瓶中，在温度37℃和5%二氧化碳的环境下，用含10%胎牛血清和1%双抗的MEM/ebs培基培养。当细胞贴满瓶底90%～100%时，使用胰酶传代。将HaCaT细胞分别接种于10%血清浓度全培基（全培基阳性对照组，10%FBS组）、2%低浓度血清培基（低血清培基组，2%FBS组）及无血清培基（对照组，0%FBS组）的24或96孔板中培养用于后续实验。

1.2.2细胞划痕实验按每孔3×104细胞浓度接种HaCaT细胞于96孔板，待板中的细胞贴壁90%以上，更换无血清培基，16 h后，将细胞如上分组，使用细胞划痕器进行细胞划痕，并继续培养，分别在24、48 h镜下观察照相比较，计算划痕损伤面积愈合率。

1.2.3CCK-8法活力检测按每孔3×104细胞浓度接种HaCaT细胞于96孔板，待板中的细胞贴壁70%，更换无血清培基，16 h后按如上分组，培养24 h和48 h后每孔加入100 μL的10%CCK-8试剂，温箱孵育30 min后用酶标仪检测A值。

1.2.4Brdu增殖实验以每孔3×104细胞接种HaCaT细胞于96孔板，待板中的细胞贴壁70%，待板中的细胞贴壁70%以上，更换无血清培基同步化培养16 h，按如上分组，24 h和48 h后，依照BrdU试剂盒说明书操作检测，在450 nm处测量A值。

2　实验结果

2.1细胞划痕实验细胞划痕培养24 h后，无血清培基组面积愈合率为（17.07±6.15）%，低血清培基组面积愈合率为（40.19±4.7）%，全培基组面积愈合率为（37.94±4.2）%。无血清培基组与全培基组、低血清培基组相比存在明显差异（P＜0.01）。细胞划痕培养48h后，无血清培基组面积愈合率为（19.95±6.6）%，低血清培基组面积愈合率为（44.68±5.17）%，全培基组（62.37±3.69）%，无血清培基组与低血清培基组、全培基组相比存在显著差异（P＜0.01）。低血清培基组与全培基组相比，存在明显差异（P＜0.01）。见图1。

2.2CCK-8细胞活力检测细胞孵育24 h后，无血清培基组A值为（0.58±0.03），低血清培基组A值为（0.68±0.05），全培基组A值为（0.62±0.03）。24 h检测，低血清培基、全培基组与无血清培基组相比存在差异（P＜0.05），低血清培基组与全培基组相比存在差异（P＜0.05）。细胞孵育48 h后，无血清培基组A值为（0.63±0.08），低血清培基组A值为（0.73± 0.03），全培基组A值为（0.88±0.05）。低血清培基组、全培基组与无血清培基组相比，均存在显著差异（P＜0.01）。低血清培基组与全培基组相比存在显著差异（P＜0.01）。与24 h相比，48 h的无血清培基组细胞平均活力增长了9%，低血清培基组细胞平均活力增长了7%，全培基组细胞平均活力增长了42%。24～48 h，全培基组细胞活力明显高于低血清培基组和无血清培基组。见表1、图2。

图1　不同培基对HaCaT细胞划痕的影响

表1　不同培基对HaCaT细胞活力的影响

表1　不同培基对HaCaT细胞活力的影响

注：与24 h的0%FBS相比，*P＜0.05；与24 h的10%FBS组相比，#P＜0.05；与48 h的0%FBS组相比，△P＜0.01；与48 h的10%FBS组相比，▲P＜0.01。

组别0%FBS组2%FBS组10%FBS组n 6 6 6 6 6 6时间（h）　CCK-8 A值24　0.58±0.030 48　0.63±0.080* 24　0.68±0.050*#48　0.73±0.030△▲24　0.62±0.038 48　0.88±0.050△

图2　不同培基对HaCaT细胞活力的影响

2.3Brdu实验细胞孵育24 h后无血清培基组吸光度为（1.13±0.28），低血清培基组吸光度为（1.58± 0.14），全培基组吸光度（1.48±0.06），与无血清培基组相比、低血清培基组、全培基组间均存在明显差异（P＜0.01）。细胞孵育48 h后无血清培基组吸光度为（1.20±0.14），低血清培基组吸光度为（1.73±0.12），全培基组吸光度为（1.87±0.11）。与24 h相比，48 h的无血清培基组细胞增殖率平均值提高了6%，低血清培基组细胞增殖率平均值提高9%，全培基组细胞增值率平均值提高了26%。24～48 h，全培基组细胞增殖能力提高速度明显高于低血清培基组和无血清培基组。见表2、图3。

表2　不同培基对HaCaT细胞增殖能力的影响

表2　不同培基对HaCaT细胞增殖能力的影响

注：与孵育24 h的0%FBS相比，*P＜0.01；与孵育48 h的0% FBS组相比，#P＜0.01。

组别0%FBS组2%FBS组10%FBS组n 6 6 6 6 6 6时间（h）　CCK-8 A值24　1.13±0.28 48　1.20±0.14 24　1.58±0.14* 48　1.73±0.12#24　1.48±0.068 48　1.87±0.11#

图3　不同培基对HaCaT细胞增殖能力的影响

3　结论与讨论

在本研究中，采用HaCaT细胞进行细胞划痕、CCK-8细胞活力检测、Brdu增殖实验，结果显示：在24 h内，低血清培基组HaCaT细胞与全培基组相比，细胞增殖能力无明显差异，细胞活力有增高的趋势。随着孵育时间的延长，细胞孵育48 h后，全培基组细胞增殖能力及细胞活力明显升高，其增殖速率明显高于低血清培基组。

细胞划痕实验常用于检测药物对皮肤角质、成纤维细胞，血管内皮、平滑肌细胞，神经元以及肿瘤细胞的迁移或侵袭能力［11-12］，是考察细胞运动能力的常用实验之一［13-14］。在划痕实验操作方法中，常推荐研究者采用无血清或低血清培养条件，减少血清对细胞增殖的影响［15-16］。但实验中，若只研究药物对细胞迁移能力的影响，同时考虑到药物孵育时间（24～72 h），研究者常采用低血清培养条件，以期降低细胞增殖能力，减少变量干扰的同时保证细胞正常的存活状态。本研究发现，划痕24 h后，低血清培基孵育细胞与全培基组相比划痕损伤愈合趋势更为明显，同时CCK-8和Brdu实验结果也证实低血清培基组与全培基组相比在24 h并不能抑制细胞增殖能力，且细胞活力较全培基组有升高的趋势。出现这种现象考虑可能有两种原因：1）低血清浓度的培基可能使该细胞产生代偿性增殖［17］。2）在24 h内，低血清培基中的营养与生长因子可能负担其增殖所需，而随着细胞增殖到一定数量，低血清培基的营养与生长因子已经不足以负担该细胞继续增殖。因此随着培养时间的延长，低血清培基组细胞的增殖速率逐渐下降。在培养48 h后，全培基组显示其划痕愈合率明显高于低血清培基组，全培基组细胞增殖能力与活力明显升高，其增殖速率明显高于低血清培基组。根据考察药物作用的不同以及药物孵育时间的长短，应重视无血清或低血清培养条件的选择。丝裂霉素（MMC）具有抑制成纤维等细胞分裂增殖的能力［18］，是划痕实验中经常使用的细胞增殖抑制剂之一［19-20］。在实验中，若只考察药物短时间内（24 h以内）对细胞迁移能力的影响，采用无血清培养条件可能较为适宜，或者考虑加入适量丝裂霉素。

上述研究提示，虽然划痕实验是一种操作简单，普遍使用的经典实验方法，但在实际的操作过程中仍应根据实验目的、细胞状态、药物选择与孵育时间等因素选择适宜的实验条件，调整实验方法，从而得到更稳定准确科学的实验结果。培养基中血清含量对HaCaT细胞生长特性及迁移能力具有重要影响，选择适宜血清培养条件有利于划痕实验观察与测定。

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Effect of serum content on the growth characteristic in the HaCaT cells

ZHANG Ze-xi，LI Mo-ling，DU Tian-le，XIA Qing-mei，ZHANG Han
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］By studying the growth characteristic of the HaCaT cells in conditions of the serum free medium，low serum medium and the serum medium.Put forward the optimization scheme of the HaCaT Wound scratch assay.［Methods］Culture HaCaT cell，grouped into 10%serum medium（positive control group），2%low serum prudential（low serum prudential group）and serum free prudential（control group），through the HaCaT wound scratch assay，CCK-8 assay，Brdu assay，analysis the HaCaT growth characteristics.［Results］With in 24 h，low serum prudential group HaCaT cells compared with the positive control group，no difference between the cell proliferation，cell vitality had increase tendency，incubation cells after 48 h，positive control group cell proliferation ability and cell viability higher than low serum prudential group.Between 24 h and 48 h，10%serum medium positive control group cell proliferation ability and speed of cell viability was obviously higher than that of low serum prudential group.［Conclusion］If it is only in the actual experiments，study drug in a short period of time（within 24 h）on HaCaT cell migration ability，the influence of culture in serum-free conditions may be more appropriate.

HaCaT cell；wound scratch assay；wound healing；optimization experiment

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0369-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.14

大学生科技创新基金（CXJJ2012C02）；国家自然基金（81373789）。

张泽曦（1993-），男，天津中医药大学中医学院2011级学生。

张晗，E-mail：zhanghan0023@126.com。

（2015-08-15）