左归降糖益肾方含药血浆对高糖培养小鼠足细胞podocin及nephrin表达的影响*

陈　聪，印红爱，喻　嵘，曾　婧，唐　元，罗文娟，张　翔，成细华

·实验研究·

左归降糖益肾方含药血浆对高糖培养小鼠足细胞podocin及nephrin表达的影响*

陈聪，印红爱，喻嵘，曾婧，唐元，罗文娟，张翔，成细华

（湖南中医药大学，长沙410208）

［目的］探讨在高糖作用下，体外培养的小鼠足细胞podocin及nephrin表达水平的变化，及左归降糖益肾方含药血浆的调控作用。［方法］将体外培养的小鼠足细胞随机分为空白组（A组）、高糖组（B组）、左归降糖益肾方含药血浆组（C组）、4-苯基丁酸含药血浆组（D组）。采用间接免疫荧光细胞化学法鉴定足细胞podocin及nephrin蛋白的表达；噻唑蓝（MTT）自动比色法检测足细胞活力，蛋白质印迹法，逆转录-聚合酶链反应法分别检测podocin及nephrin蛋白或mRNA表达水平的变化。［结果］与A组相比，B组足细胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表达水平均降低（P＜0.01）；与B组相比，C组、D组足细胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表达水平均升高（P＜0.01）；与C组相比，D组足细胞活力升高（P＜0.05）。［结论］podocin及nephrin蛋白或mRNA表达水平的降低，是足细胞损伤的分子机制之一；左归降糖益肾方含药血浆可以通过升高podocin及nephrin蛋白或mRNA的表达水平，从而保护足细胞。

左归降糖益肾方；高糖；足细胞；Podocin；Nephrin

足细胞位于肾小球基底膜外侧，是终末分化的上皮细胞，几乎没有再生能力，是肾小球滤过的最后一道屏障。足细胞的损伤和剥脱，与糖尿病肾病（DN）早期发病相关［1-3］。podocin及nephrin是足细胞裂孔膜跨膜蛋白分子，其结构与功能的改变参与了DN的发生、发展［4-5］。高糖环境是引起足细胞损伤及（或）死亡的原因之一，其具体分子机制尚不清楚。左归降糖益肾方含熟地黄、黄芪、山药等9味药，课题组前期研究发现其可改善糖尿病肾病MKR鼠肾功能，保护足细胞结构［6］。在前期研究基础上，本文进一步探讨左归降糖益肾方含药血浆对高糖诱导足细胞损伤的调控作用和部分可能分子机制，为糖尿病肾病的靶向治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞小鼠足细胞购自北京协和细胞中心（Mouse podocyte；3111C0001CCC000230）。以含10%胎牛血清，90%的DMEM完全培养基（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、25 mmol/L葡萄糖）在细胞培养室5%二氧化碳（CO2），37℃培养箱中培养。期间2～3 d更换培养液1次，相差显微镜观察细胞形态，待细胞体积明显增大，向四周伸出足突分化成熟后用于实验。实验场地主要由湖南中医药大学医学基础教学实验中心提供。

1.1.2主要试剂总RNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司，批号DP431。逆转录试剂盒，购自Fermentas公司，批号#K1622。PCR引物，由上海生工公司合成。Rabbit nephrin antibody购自Abcam公司，批号ab58968。Rabbit podocin antibody购自SANTA公司，批号SC-21009。Mouse GAPDH antibody购自SANTA公司，批号SC-365062。葡萄糖（分析纯），购自上海国药集团化学试剂有限公司，批号10010518。Alexa Fluor®488标记山羊抗兔IgG（重链+轻链）二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZF-0511。

1.1.3主要仪器TG16W型台式离心机，购自长沙平凡仪器仪表有限公司。DCW-3510节能型智能恒温槽，购自宁波新芝生物科技股份有限公司。WD-9402 A型PCR扩增仪，购自北京六一仪器厂。F1-F2 Fuses Type T2A型化学发光凝胶成像分析系统，购自Bio-Rad公司。BioPhotometer plus型核酸蛋白分析仪，购自Eppendorf公司。AE 31型倒置荧光显微镜，购自Motic公司。

1.1.4含药血浆制备左归降糖益肾方：由熟地黄、黄芪、山药等9味药组成（中药汤剂制备：经水煎煮2次，混合过滤后，浓缩制备成含生药浓度为2 g/mL的药液，经灭菌后置4℃冰箱中备用）。君药熟地黄为玄参科地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）干燥块根的炮制加工品（酒炖或蒸法），黄芪为豆科植物蒙古黄芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根，经湖南中医药大学第一附属医院王宇红教授鉴定均为正品。Wistar大鼠40只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，许可证号：SYXK（湘）2013-0005。按随机数字表法随机分为4组，每组10只。采用连续7 d，3倍量给药，每日1次。按人与大鼠体表面积换算法计算给药量，中药给药剂量为30 g/kg，灌胃给药容量为15mL/kg；内质网应激分子伴侣4-苯基丁酸（4-PBA），生理盐水稀释，浓度为0.20 g/mL，剂量为3 g/kg，灌胃给药容量为15 mL/kg；空白血浆采用相同动物不给药同法收集。末次给药后1h腹主动脉插管取血，EDTA抗凝，收集血浆0.22 μm滤膜过滤，56℃水浴灭活30 min后，分装置-20℃冰箱备用。

1.2方法用完全培养基调细胞密度为1×105/mL的细胞悬液，然后转种培养瓶中，加入完全培养基总体积5 mL，放入CO2培养箱中培养至贴壁。用不含胎牛血清的DMEM培养液同步化处理12 h后，分为空白组（A组，10%空白血浆的DMEM培养基，终浓度25 mmol/L葡萄糖），高糖组（B组，含10%空白血浆的DMEM培养基，终浓度200 mmol/L葡萄糖），左归降糖益肾方含药血浆组（C组，10%含药血浆的DMEM培养基，终浓度200 mmol/L葡萄糖），4-PBA含药血浆组（D组，10%含药血浆的DMEM培养基，终浓度200 mmol/L葡萄糖）。根据课题组预实验结果，选择在48 h后收集细胞。用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化细胞，加入完全培养基终止消化，离心管收集细胞悬液，1 000 r/min，5 min离心，弃上清；用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀2～3次，1 000 r/min，5 min离心，弃上清；置冰上，用于Western blot，逆转录-聚合酶链反应等相关检测。

1.2.1逆转录-聚合酶链反应用总RNA提取试剂盒抽提其总RNA，采用核酸蛋白分析仪测定其浓度。取1 μg总RNA，随后用逆转录试剂盒以Oligo（dT）为引物进行逆转录反应。以GAPDH为内参基因。应用Primer 5.0软件，根据GenBank中小鼠的序列设计引物。Podocin：上游5’-TGAGGATGGCGGCTGAGAT-3’，下游5’-GGTTTGGAGGAACTTGGGT-3’，产物大小193 bp。Nephrin：上游5’-CC CAACACTGGAAGAGGTGT-3’，下游5’-CTGGTCGTAGATTCCCCTTG-3’，产物大小211 bp。GAPDH：上游5’-ACTTGAAGGGTGGAGCCAAA-3’；下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACA-3’，产物大小608 bp。选择最适条件分别对podocin、nephrin、GAPDH进行聚合酶链反应（PCR）扩增，PCR产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad化学发光凝胶成像分析系统分析电泳条带灰度值，分别以podocin，nephrin和GAPDH电泳条带灰度值比值计算 podocin及nephrin mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.2.2蛋白质印迹法按试剂盒操作抽取总蛋白，取出已变性的蛋白样品。每孔加40 μg蛋白样品电泳，积层胶电压80 V，分离胶电压120 V。电泳结束后转膜70 min，将转有蛋白的膜置于5%牛血清白蛋白中封闭，37℃，1 h，置于1抗（nephrin、podocin 1抗分别用封闭液1∶500、1∶400稀释，GAPDH内参按照1∶800稀释）中孵育2h，PBST洗4次，每次10 min，分别加入2抗（1∶40 000或1∶80 000），室温孵育1 h，PBST洗4次。将膜风干，贴在玻璃纸上，加底物，做化学发光，得到胶片。将背景较高的底片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，观察到理想的结果时，终止反应，用水清洗以去除不需要的背景。GAPDH蛋白为内参，目的条带灰度值/同个样品的GAPDH灰度值表示目的基因蛋白表达水平，实验重复3次，取均值。

1.2.3间接免疫荧光细胞化学法在无菌状态下，将防脱盖玻片分别放入6孔培养板中。每孔均匀加入含细胞1×105/mL的完全培养基悬液1mL，放入CO2培养箱中培养至贴壁。用不含胎牛血清的DMEM培养基同步化处理12 h后，分为A组、B组、C组、D组。分别加入相应培养基，48 h后收集细胞，用PBS洗涤5min，3次，加入4%多聚甲醛固定（25～30min），PBS洗5～10 min，3次。用1%曲拉通X-100（PBS配制），2～5min，PBS洗5～10min，3次。3%双氧水（H2O2）配制，室温孵育10 min，PBS洗5～10 min，3次。分别加入兔抗小鼠 podocin及 nephrin多克隆一抗（1∶100，PBS稀释），阴性对照以PBS代替一抗，过夜。PBS洗10 min，3次。加入Alexa Fluor®488标记山羊抗兔IgG二抗（1∶200，PBS稀释，避光），37℃，40 min，PBS洗10 min，3次。晾干，抗荧光淬灭封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察，拍片。

1.2.4噻唑蓝（MTT）自动比色法将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔约10 000个，每组各5复孔，贴壁后，分别加入相应培养基，孵育48 h后，终止反应，吸除多余培养液，PBS洗2次后，每孔加入含MTT（0.5 mg/mL）的DMEM培养液（不含胎牛血清）150 μL，37℃继续孵育4 h后，终止培养，吸弃废液，不洗，每孔加入100 μL DMSO，避光置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上570 nm波长检测各孔吸光值。

1.2.5统计学处理数据满足正态性及方差齐性检验，采用单因素方差分析；若不满足，则采用非参数检验，P＜0.05有统计学意义。使用SPSS 17.0统计软件处理，结果以均数±标准差表示。

2　结果

2.1足细胞的鉴定细胞接种12 h后见贴壁，24 h后见细胞突起长出，2～3 d细胞可达80%融合，足细胞呈星形伸出树枝状突起，相邻细胞间形成相互连接。免疫荧光染色可见足细胞特异性蛋白podocin及nephrin表达阳性。见图1。

图1　足细胞podocin及nephrin蛋白的表达（免疫荧光染色×400）

2.2检测结果与A组相比，B组足细胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表达水平均降低（P＜0.01）；与B组相比，C组、D组足细胞活力，podocin及 nephrin蛋白或mRNA的表达水平均升高（P＜0.01）；与C组比较，D组足细胞活力升高（P＜0.05），但podocin及nephrin蛋白或mRNA的表达水平，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1、表2、图2。

表1　左归降糖益肾方含药血浆对足细胞活力、podocin及nephrin mRNA表达水平的影响

表1　左归降糖益肾方含药血浆对足细胞活力、podocin及nephrin mRNA表达水平的影响

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，##P＜0.01；与C组比较，△P＜0.05。

组别A B C D n　3 3 3 3 nephrin mRNA/ GAPDH mRNA 0.66±0.05　0.85±0.03　0.61±0.04 0.43±0.01**　0.42±0.01**　0.29±0.08** 0.57±0.01##　0.50±0.01**##　0.45±0.02**##0.64±0.04#△　0.51±0.04**##　0.48±0.01*##A值　podocin mRNA/ GAPDH mRNA

表2　左归降糖益肾方含药血浆对足细胞podocin及nephrin蛋白表达水平的影响

表2　左归降糖益肾方含药血浆对足细胞podocin及nephrin蛋白表达水平的影响

注：与A组比较，**P＜0.01；与B组比较，##P＜0.01。

组别A B C D n 3 3 3 3 podocin/GAPDH　nephrin/GAPDH 0.75±0.03　0.96±0.03 0.33±0.01**　0.42±0.02** 0.53±0.02**##　0.63±0.02**##0.53±0.01**##　0.65±0.02**##

图2　各组podocin和nephrin蛋白及mRNA的表达水平

3　讨论

足细胞是糖尿病肾病的关键靶细胞之一，podocin、nephrin是足细胞特异性蛋白，是维持足细胞裂孔膜完整性的重要组成部分，对维持裂孔膜的结构完整与功能、足细胞正常形态附着和运动、介导上皮细胞与基质的相互作用从而影响肾小球基底膜的通透性和基质的沉积等具有重要的作用［4-5］。有研究发现DN患者足细胞podocin蛋白或nephrin蛋白表达降低，且表达减少与尿蛋白增加负相关［6-7］。

相关研究及本实验进一步证实，nephrin和podocin分布方式相似，主要分布于胞质内，核膜及胞膜的表面，以胞膜的染色最深；在胞浆呈放射性沿着细胞骨架分布；且在细胞膜上呈连续性的线状分布［8］。本实验高糖200 mmol/L体外处理足细胞48 h后，发现与空白组葡萄糖组比：足细胞活力下降，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表达水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。证实高糖是造成足细胞损伤的原因之一；足细胞损伤的分子机制之一是podocin蛋白及mRNA的表达水平降低。左归降糖益肾方含药血浆治疗后，足细胞podocin及nephrin蛋白或mRNA表达水平升高；提示左归降糖益肾方含药血浆可以通过升高podocin及nephrin蛋白或mRNA的表达水平，从而保护足细胞。

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Effects of Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma on Podocin and Nephrin expressions in podocyte cells of high glucose condition in vitro

CHEN Cong，YIN Hong-ai，YU Rong，ZENG Jing，TANG Yuan，LUO Wen-juan，ZHANG Xiang，CHENG Xi-hua
（Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

［Objective］To investigate the levels of protein and mRNA expressions of podocin and nephrin in podocyte cells cultured in high glucose condition in vitro，and the effects of Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma on podocin and nephrin expressions in podocyte cells.［Methods］Cultured podocyte cells were divided into four groups：control group（A group），high glucose group（B group），Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma group（C group）and 4-Phenylbutyric acid group（D group）.After incubation for 48 h，the cell viability was detected by MTT colorimetry assay.The protein and mRNA expressions of Podocin and Nephrin were analyzed by western blot or reverse transcription-polymerase chain reaction respectively.［Results］Induced by high g1ucose，the viability of podocyte cells was significantly decreased of B group，and their expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA were downregulated，as compared with A group（P＜0.01）；as compared with B group，the expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA of podocyte cells of C group and D group were upregulated，and the viability of podocyte cells were significantly increased（P＜0.01）；and compared with C group，the cell viability was significantly increased of D group（P＜0.05）.［Conclusion］The lower level expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA were the molecular mechanisms of podocyte injury.ZJYD plasma can repair the damaged podocyte by upregulating Podocin and Nephrin protein or mRNA expressions.

Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma；high glucose；podocyte；Podocin；Nephrin

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0338-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.06

国家自然科学基金面上项目（81273753）；湖南省自然科学基金（12JJ2048，12JJ9031）；湖南省研究生科研创新项目（CX2013B321）。

陈聪（1985-），女，博士研究生，研究方向为中医药防治糖尿病肾病的研究。

喻嵘，E-mail:yuron@21cn.com。

（2015-07-15）