延胡索药材及饮片的UPLC质量控制方法*

罗琛艳，李　浩，肖　洋，段金芳，刘　影，窦志英

延胡索药材及饮片的UPLC质量控制方法*

罗琛艳，李浩，肖洋，段金芳，刘影，窦志英

（天津中医药大学，天津300193）

［目的］检测延胡索药材及饮片中有效成分的含量，建立延胡索药材和饮片的超高液相色谱法（UPLC）质量控制方法。［方法］采用UPLC检测方法，ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液，调pH值至5.0（A），流速：0.3 mL/min，柱温：45℃，进样量：5 μL；梯度洗脱。以延胡索乙素和去氢紫堇碱的含量为指标对延胡索的水提液进行检测。［结果］样品中延胡索乙素的含量在0.229 1～0.775 5 mg/g之间，去氢紫堇碱的含量在0.781 0～2.931 0 mg/g之间，不同样品延胡索乙素和去氢紫堇碱的含量差异很大。［结论］UPLC法的灵敏度更高、检测速度更快，适用于组分多、成分复杂的中药材的分析及质量的评价。

延胡索；UPLC；延胡索乙素；去氢紫堇碱

延胡索为罂粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥块茎［1］。能“行气中血滞，血中气滞，专治一身上下诸痛”，止痛效果明显且无成瘾性［2］，应用广泛。延胡索主要的药效成分为生物碱，已经鉴定近40个生物碱，其中延胡索乙素的止痛效果最佳［3-5］，去氢紫堇碱对心血管系统作用明显［6-8］，但生物碱的检测、定量较复杂且耗时。超高液相色谱（UPLC）法分析法精度高［9］，目前已广泛应用于代谢组学、药物分析、环境、食品以及化妆品［10-16］等，在中药分析方面运用逐渐增多。延胡索的UPLC检测方法较少，实验建立延胡索药材、饮片中延胡索乙素和去氢紫堇碱的UPLC快速定量法，为延胡索的质控、制剂、代谢组学以及复方研究等奠定基础。

1　仪器、试药和样品

UPLC超高效液相色谱仪（Waters公司），醋（天津市天立独流老醋股份有限公司），甲醇（色谱纯/天津市化学试剂批发公司），甲酸（色谱纯/天津市化学试剂批发公司），氨水（分析纯/天津市化学试剂批发公司），乙腈（Sigma公司），水（杭州娃哈哈集团有限公司）；延胡索乙素（中国药品生物制品检定所，批号110726-201011），去氢紫堇碱（Zhongxin Innova Laboratories，CAS：30045-16-0）。

2　样品信息

样品信息见表1。

3　实验方法

3.1色谱条件Waters公司ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。检测波长：280 nm。流动相：乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液，氨水调pH值至5.0（A）。流速：0.3 mL/min。柱温：45℃。进样量：5 μL。梯度洗脱：0～9 min，15%～29%B；9～15 min，29%～40%B；15～16 min，40%～50%B；16～16.1 min，50%～15%B。见图1、图2。

3.2标准品溶液的制备精密称取延胡索乙素和去氢紫堇碱标准品1.40、1.66 mg，分别加甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，得到浓度分别为0.140、0.166 g/L的标准品溶液。

量取上述延胡索乙素标准溶液1 mL，去氢紫堇碱标准溶液2 mL，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，配成浓度分别为0.014 0、0.033 2 g/L的混标溶液。

3.3样品溶液的制备精密称取10 g饮片，8倍量水，浸泡40 min，一次回流提取45 min，过滤，滤渣加6倍量水，回流提取30 min，过滤，合并滤液，浓缩，移至100 mL容量瓶中，加水定容。精密移取300 μL样品，加入3倍甲醇混匀，离心（10000r/min，10min），取上清液过0.22 μm微孔滤膜，备用。

3.4方法学

3.4.1线性关系考察分别精密移取延胡索乙素、去氢紫堇碱储备液适量，用甲醇稀释一系列浓度的对照品溶液，延胡索乙素的浓度分别为28.0、24.5、21.0、17.5、14.0、10.5、7.0、3.5 mg/L，去氢紫堇碱的浓度分别为66.4、58.1、49.8、41.5、33.2、24.9、16.6、8.3μg/mL，进样量为5 μL，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，延胡索乙素的回归方程为=15 742X+2 455，相关系数r= 0.999 6，线性范围在0.017 5～0.140 0 μg；去氢紫堇碱的回归方程为=28 506X+16 093，相关系数r= 0.999 1，线性范围0.041 5～0.332 0 μg。

表1　样品信息

图1　标准品色谱图（a：去氢紫堇碱；b：延胡索乙素）

图2　延胡索样品图

3.4.2精密度实验吸取延胡索乙素和去氢紫堇碱混标溶液，在色谱条件“3.1”下，连续进样6针，记录峰面积，计算RSD%分别为：0.51%、0.34%，表明仪器精密度良好。

3.4.3稳定性实验精密称取药材，按“3.3”项提取处理方法，按“3.1”色谱条件在0、2、4、8、12、24 h分别进样，记录峰面积，计算RSD分别为：0.61%、0.67%，表明样品中延胡索乙素和去氢紫堇碱在24 h内稳定。

3.4.4重现性实验精密称取同1个样品6份，按“3.3”提取处理方法，在“3.1”色谱条件下测定峰面积，计算各对照品的质量分数，结果延胡索乙素的RSD为：2.44%，去氢紫堇碱的RSD为：2.94%，表明重现性良好。

3.4.5加样回收实验精密称定已测知含量的饮片约5.0 g，加入延胡索乙素和去氢紫堇碱标准品，相当于生药药材中延胡索乙素的100%、去氢紫堇碱的100%，按“3.3”项下操作制备供试品溶液，在“3.1”色谱条件下分析。见表2。

表2　加样回收率实验

4　溶出量测定结果

根据“3.3”项下方法制备样品，用“3.1”项色谱条件进行含量测定，以延胡索乙素（权重60%），去氢紫堇碱（权重40%）的加权含量（mg/g）为指标，具体结果见表3。

表3　延胡索乙素、去氢紫堇碱的含量及加权得分mg/g

表3　延胡索乙素、去氢紫堇碱的含量及加权得分mg/g

序号　延胡索乙素　去氢紫堇碱　加权总含量1　0.461 3±0.012 5　1.519 2±0.034 8　0.884 5 2　0.379 6±0.014 5　0.966 0±0.080 1　0.614 2 3　0.316 3±0.018 0　0.781 0±0.067 0　0.502 2 4　0.681 7±0.004 3　1.311 6±0.009 2　0.933 7 5　0.775 5±0.021 5　1.442 3±0.008 4　1.042 2 6　0.605 2±0.014 5　2.670 8±0.160 9　1.431 4 7　0.289 7±0.014 3　2.687 1±0.175 5　1.248 7 8　0.287 5±0.016 4　2.769 3±0.171 5　1.280 2 9　0.414 4±0.031 0　1.501 1±0.101 7　0.849 1 10　0.229 1±0.003 6　2.419 9±0.138 5　1.105 4 11　0.428 7±0.045 8　1.880 0±0.066 1　1.009 2 12　0.632 9±0.016 8　2.729 9±0.077 8　1.471 7 13　0.323 0±0.025 2　2.931 0±0.223 0　1.366 2 14　0.609 0±0.035 0　1.289 6±0.052 1　0.881 2 15　0.699 2±0.016 7　2.099 2±0.021 7　1.259 2 16　0.518 8±0.043 9　2.972 1±0.198 6　1.500 1 17　0.632 5±0.005 9　2.538 1±0.046 4　1.394 7 18　0.527 9±0.030 7　2.570 1±0.150 6　1.344 8 19　0.476 7±0.023 2　1.591 5±0.091 2　0.922 6 20　0.381 9±0.009 7　1.810 0±0.104 0　0.953 1

延胡索乙素的含量在0.229 1～0.775 5 mg/g之间，去氢紫堇碱的含量在0.781 0～2.931 0 mg/g之间，延胡索乙素和去氢紫堇碱加权后的溶出量在0.502 2～1.471 7 mg/g之间。

5　讨论

UPLC法是在高效液相色谱法（HPLC）系统的基础上，提高色谱柱效能达到的高分析精度。文献报道［17-18］HPLC法检测延胡索成分，达到色谱峰分离度良好，分析时间需40～70 min。本实验检测延胡索的分析时间只需13 min，检测出10个色谱峰，延胡素乙素和去氢紫堇碱的保留时间为8.06 min和6.78 min。UPLC比HPLC更快速、简便、灵敏、有机试剂用量少［19-20］。在实验过程中，多次出现系统堵塞现象，对进入UPLC系统的样品水提液都需流动相沉淀除杂。

由实验结果可知，延胡索样品中延胡索乙素最低含量为0.229 1 mg/g，最高为0.775 5 mg/g；去氢紫堇碱的含量最低为0.7810mg/g，最高为2.9310mg/g；含量差异显著。2010版药典中以浓氨水-甲醇（1∶20）的混合液为提取溶剂，对延胡索中延胡索乙素的含量有限定；临床汤方应用多以水为溶剂，建议规定水提液中延胡索乙素及其它生物碱含量的最低限度。

本方法不仅可以用于延胡索药材和饮片中有效成分的检测，同时在已发表文章［21］用于复方金铃子散、元胡止痛片和延胡索汤中延胡索有效成分的含量测定，建立了延胡索药材、饮片和复方的UPLC快速评价方法。

［1］国家药典委员会.中国药典2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:70-71.

［2］金国章，王月娥，张振德，等.延胡索的药理研究—ⅩⅢ.延胡索乙素对动物成瘾性的实验［J］.生理学报，1978，30（1）: 67-74.

［3］胥彬，金国章.延胡索的药理研究Ⅱ，延胡索乙素和丑素的耐药性［J］.生理学报，1957，21（2）:158-162.

［4］杜兰芳，杜永平，徐晖，等.延胡索乙素对大鼠外周镇痛作用的实验研究［J］.中国中医急症，2009，18（5）:781-783.

［5］王殊秀，冷玉芳，高向梅，等.延胡索乙素对大鼠慢性神经病理性疼痛的影响［J］.临床麻醉学杂志，2012，28（7）:705-707.

［6］蒋燮荣，吴庆仙，施化莲，等.脱氢紫堇碱对心血管系统的药理作用［J］.药学学报，1982，17（1）:61-65.

［7］付彦君，尤春来，张效禹，等.去氢紫堇碱对大鼠离体胸主动脉平滑肌的作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2001，15（5）:326-329.

［8］赵昕.脱氢紫堇碱对培养心肌细胞内钙调控的作用机制的研究［D］.沈阳：中国医科大学，2004.

［9］石俊敏，管佳，张庆文，等.超高效液相色谱在药物分析中的应用［J］.药物分析杂志，2008，28（9）:1583-1588.

［10］马晓丽，孟磊，李新霞，等.基于UPLC/Q-TOF MS的糖尿病尿液代谢组学研究［J］.分析测试学报，2014，33（6）:621-627.

［11］刘芷，贾英，赵旭，等.五味子的UPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2014，45（11）:1631-1633.

［12］郑雅楠，廖茂梁，孙卫，等.穿山龙超高效液相色谱特征指纹图谱的研究［J］.现代药物与临床，2015，30（1）:28-32.

［13］陈勇，陈重均，李劲，等.超高效液相色谱串联质谱法检测三七药材中10种真菌毒素［J］.药学学报，2015，50（1）: 81-85.

［14］袁培耘，陈卓，杨成阁，等.ASE-UPLC-PDA法测定PM2.5中16种多环芳烃［J］.环境科学与技术，2015，38（2）:89-93.

［15］徐能斌，钱飞中，冯加永，等.超高效液相色谱-质谱法检测土壤中的羟基化多溴联苯醚［J］.分析化学，2015，43（2）: 251-256.

［16］谭建华，李慧勇，席绍峰，等.超高效液相色谱法同时鉴定育发化妆品中17种植物提取物标识成分［J］.分析化学，2015，43（1）:110-114.

［17］窦志英，孙巍，田丽莉，等.HPLC法比较延胡索生品与不同炮制品中3种有效成分的含量［J］.中药材，2007，30（4）: 399-401.

［18］罗利云.不同产地延胡索有效成分的含量测定［J］.临床医学工程，2011，18（10）:1622-1624.

［19］陈佳，王钢力，姚令文，等.UPLC和H PLC方法对丹参药材中丹酚酸B含量测定结果的比对［J］.药物分析杂志，2008，28（5）:749-751.

［20］吴樱，杨义芳，罗明利，等.康视明合剂中柚皮苷的UFLC法测定［J］.中国医药工业杂志，2007，38（12）:868-869.

［21］吴梓君，张静怡，罗琛艳，等.延胡索生熟饮片在复方配伍后药效成分溶出规律研究［J］.天津中医药大学学报，2014，33（3）:181-184.

The UPLC quality control method of Corydalis Rhizamo herbs and herbal pieces

LUO Chen-yan，LI Hao，XIAO Yang，DUAN Jin-fang，LIU Ying，DOU Zhi-ying
（Tianjin University of Traditional Chinese medicine，Tianjin 300193，China）

［Objectiye］To develop a UPLC quality control method of Corydalis Rhizamo herbs and herbal pieces by determining the contents of active components.［Methods］The separation was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column in the UPLC method.The mobile phases consisted of acetonitrile（B）and 0.1%formic acid aqueous solution（A，pH=5.0）with gradient elution.The flow rate and column temperature were set at 0.3 mL/min and 45℃，respectively.The injection volume was 5 μL.The contents of tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline were taken as indexes for the water extract of corydalis rhizoma.［Results］The content of tetrahydropalmatine was in the range of 0.229 1～0.775 5 mg/g and that of dehydrocorydaline was 0.781 0～2.931 0 mg/g. The contents of tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline varied greatly in different samples of Corydalis Rhizamo.［Conclusion］Tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline were stable in the water extract，which could be used as the index components for the quality control of Corydalis Rhizamo.The UPLC method was fast，efficient and of higher sensitivity.It was suitable for the rapid detection of active components and the quality evaluation of traditional Chinese medicines.

Corydalis Rhazamo；UPLC；tetrahydropalmatine；dehydrocorydaline

R284

A

1673-9043（2015）06-0357-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.11

2011年中医药行业科研专项（20110700709）。

罗琛艳（1989-），女，硕士研究生，研究方向为中药成分研究和质量控制。

窦志英，E-mail：zhiyingdou@163.com。

（2015-07-14）