硝普钠对铜胁迫下水稻幼苗生长的缓解效应

叶伟栋，李赛男，鲍若栋，茅其胜，应濠泽，杜照奎＊，2，3

硝普钠对铜胁迫下水稻幼苗生长的缓解效应

叶伟栋1，李赛男1，鲍若栋1，茅其胜1，应濠泽1，杜照奎＊1，2，3

（1.台州学院生命科学学院，浙江台州318000；2.浙江省植物进化生态学与保护重点实验室，浙江台州318000；3.台州学院生态研究所，浙江台州318000）

为探讨外源一氧化氮在缓解重金属Cu2+胁迫中的作用，以水稻“苏秀9号”为试料，通过水培试验研究了在重金属Cu2+处理下硝普钠对水稻幼苗生长和抗氧化能力的影响。试验表明30μmol·L-1的CuCl2处理显著降低了水稻幼苗的株高、根长、根数和鲜重；并且提高了叶中H2O2和O2.-的含量，使幼苗遭受到严重的氧化胁迫，导致MDA含量和相对电导率显著提高；叶中SOD活性、POD活性、叶绿素含量和可溶性蛋白质含量均显著下降。外源添加50μmol·L-1硝普钠后，30μmo l·L-1的CuCl2处理的幼苗株高、根长等较Cu2+处理显著提高，叶中H2O2和O2.-的含量明显下降，MDA含量和相对电导率显著降低；叶中SOD活性、POD活性、APX活性、CAT活性、叶绿素含量和可溶性蛋白质含量均显著升高。研究表明适量的SNP可以提高水稻抗氧化酶活性，降低ROS的含量，减缓叶片的膜脂过氧化程度，从而，更好地对抗重金属Cu2+的毒害作用。

水稻；重金属；一氧化氮；抗氧化酶

0　引言

近年来，由于电子垃圾拆解等人类活动所带来的土壤重金属污染已经成为环境污染治理的难题［1，2］。据测算，我国重金属污染的农业土地约2.5×107hm2，占全国耕地总面积的20%［3］，土壤重金属污染问题已引起了人们的广泛关注。重金属铜（Cu）是植物生长必须的微量元素，然而过量的Cu对植物产生毒害［4］，如：抑制光合作用和色素合成、产生氧化胁迫及其它代谢紊乱，影响植物的正常生长［5］。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物体内的信号分子，它不仅调节着植物种子的萌发、生长、发育和衰老等过程，而且还参与植物对生物和非生物胁迫的响应［6］。研究表明外源NO可缓解植物体如铜［7］、镉［8］、铬［9］、铅［10］、铁、锌和锰［11］等重金属的毒害，其机理是通过激活抗氧化酶系统和提高金属硫蛋白（metallothionein）的含量间接消除活性氧（reactive oxygen species，ROS），降低了重金属引起的氧化胁迫，从而提高植株对重金属胁迫的抗性［12］。

水稻（Oryza sativa）不仅是重要的单子叶模式植物，而且还是世界上最重要的粮食作物之一。研究NO在降低水稻Cu毒害过程中的作用和生理机制，不仅有利于降低由于Cu污染造成的水稻减产，而且还有利于减少稻米中的Cu富集量，保证人们的身体健康，但有关施加外源NO缓解水稻Cu毒害的相关报道较少。本实验主要分析外源NO供体硝普钠（sodium nitrop russide，SNP）对Cu2+胁迫下水稻幼苗生长和生理特性的影响，以探明NO对提高小麦耐重金属的作用，为阐明NO提高植物耐重金属性的机理提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料的培养

水稻品种为苏秀9号，由嘉兴市农业科学研究院选育，购自临海市种子公司。种子用0.1%的HgCl2消毒后，流水冲洗干净，再在清水中浸泡24h。将种子置于铺有双层滤纸的培养皿中，28℃培养箱中暗发芽2d，选择出芽一致的幼苗置于珍珠岩上，Hoagland营养液浇灌培养，光照培养箱控制培养条件，光周期为12h，温度为27℃，光强约为300μm ol·m-2·s-1，相对湿度为70%。

1.2Cu2+和SNP浓度的选择

Cu2+浓度的选择。将培养箱暗发芽2d的水稻幼苗用0、10、30、50和100μm ol·L-1CuCl2进行处理，CuCl2以Hoagland营养液配制，每天更换一次处理液。7d后测量水稻的株高、根长、根数和鲜重，筛选出Cu2+胁迫的适合浓度。

SNP浓度的选择。将培养箱暗发芽2d的水稻幼苗用含30μmol·L-1CuCl2的Hoagland营养液进行处理，同时在溶液中加入0、50、100和150μm o l·L-1SNP，每天更换一次处理液。7d后测量水稻的株高、根长、根数和鲜重，筛选出SNP的适合浓度。

1.3生理指标测定及方法

筛选出Cu2+浓度和SNP浓度后，将28℃培养箱中暗发芽3d的水稻幼苗进行以下三种处理：（1）Hoagland营养液；（2）含Cu2+的Hoagland营养液；（3）含Cu2+的Hoagland营养液，且加入SNP。处理7 d后，测量以下指标。

叶片电导率采用电导仪法测定；丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）法；过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法；过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定采用分光光度法；可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。以上操作均参照高俊凤方法［13］。

叶绿素相对含量（叶片SPAD值）的测定：选取第3片功能叶，采用SPAD502微型叶绿素仪进行测定。

H2O2的染色：染色溶液为0.1g·L-1二胺基联苯胺 （Diam inobezidine，DAB），用50mMTris-醋酸（pH5.0）溶解。将叶片浸泡在染色液中，25℃黑暗过夜，再将叶片置于乙醇:乳酸:甘油（3∶l∶1）固定液中煮沸l0m in，冷却，将叶片转入新鲜的固定液中，室温下过夜，拍照［14］。

O2.-检测：染色液为0.1g·L-1的NBT，用25mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.6）溶解。将叶片浸泡染色液中，25℃黑暗保存16h后，置于乙醇:乳酸:甘油（3∶l∶1）固定液中煮沸10m in，冷却，将叶片转入新鲜的固定液中，室温下过夜，拍照［14］。

1.4数据分析

每种处理均重复测定4次，数据以平均值±标准误表示。运用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析（One-w ay ANOVA），并采用Duncan新复极差检验法进行多重比较（P＜0.05）。

2　结果与分析

2.1Cu2+胁迫对水稻幼苗的生长的影响

水稻幼苗受Cu2+胁迫7d后，与对照相比，10μmol·L-1Cu2+处理并没有显著改变水稻的株高、根长、根数和鲜重（图1）。但随着Cu2+浓度的增加，水稻的株高、根长、根数和鲜重较对照均显著下降（P＜0.05），30、50和100μm ol·L-1Cu2+处理的水稻株高较对照降分别低47.00%、69.53%和76.82%，根长较对照分别降低69.16%、83.77%和84.09%，根数较对照分别降低35%、80%和80%，鲜重较对照分别降低37.57%、51.97%和54.00%，表明Cu2+处理显著抑制了水稻幼苗的生长。根据生长数据结果，我们选择30μm ol·L-1Cu2+处理浓度进行后续试验。

图1　Cu2+胁迫对水稻幼苗生长的影响Fig.1 Effects of Cu2+stress on the grow th of rice seedlings

2.2外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗生长的影响

将培养箱暗发芽2d的水稻幼苗用含30μm o l·L-1CuCl2的Hoagland营养液进行处理，同时在溶液中分别加入0、50、100和150μmol·L-1SNP，培养7d后测量水稻生长指标。结果表明：低浓度的SNP能显著提高水稻幼苗的株高、根数和鲜重，但根长却没有显著性变化，而高浓度的SNP则显著抑制了这些指标（图2）。与30μmol·L-1Cu2+处理相比，添加50μm ol·L-1SNP处理的水稻株高、根数和鲜重分别增加86.80%、50.00%和29.62%，表明适当浓度的SNP处理能显著提高Cu2+胁迫下水稻幼苗的生长。根据生长数据结果，我们选择50μmol·L-1SNP处理浓度进行后续试验。

图2　外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗生长的影响Fig.2 Effects of nixie oxide on the grow th of rice seedlings under Cu2+stress

2.3外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗H2O2和O2.-含量的影响

外界环境条件的胁迫（如：冷、热、盐、重金属和臭氧等）诱发活性氧ROS（如H2O2、O2.-和1O2等）的产生，从而造成氧化胁迫已经是一种普遍的现象［15］。与对照（Hoagland营养液培养）相比，Cu2+处理的水稻幼苗叶中呈现较深的颜色，且面积更大，表明叶中产生了大量的H2O2（图3A）和O2.-（图3B），受到了较为强烈的活性氧胁迫；而添加SNP处理的水稻叶片中虽然也被染上颜色，但较Cu2+处理处的要浅，表明SNP的添加减轻了H2O2和O2.-对水稻的胁迫。

图3　外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗叶中H2O2（A）和O2.-（B）含量的影响Fig.3 E ffect of exogenous NO on H2O2（A）and O2-（B）in leaves of rice seed lings under Cu2+stress

2.4外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗MDA含量和相对电导率的影响

MDA是植物组织在器官衰老或在逆境条件下膜脂过氧化作用的产物，它会降低膜中不饱和脂肪酸的含量，使膜的流动性降低，损害膜系统；而膜受损后，胞内离子外流也会导致电导率增加。因此，MDA含量和相对电导率的高低可以用来表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度［16］。水稻幼苗受到Cu2+胁迫后，叶片中MDA含量和相对电导率分别增加45.77%和22.98%，与对照差异显著；而Cu2+处理且外施SNP后，与Cu2+处理相对，MDA含量和相对电导率均显著下降，值与对照无显著性差异（图4）。表明外源NO可以降低水稻幼苗在重金属铜胁迫下的氧化伤害。

图4　外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗叶MDA含量和相对电导率的影响Fig.4 Effects of exogenous nitric oxide on the MDA contents and relative electrical conductivity in rice leaves under Cu2+stress

2.5外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗叶片保护酶活性的影响

低水平的ROS不会对植物造成伤害，但是逆境胁迫导致ROS的迸发通常会对植物造成强烈的氧化胁迫。经过长期的适应与进化，植物体内形成了ROS清除系统，以应对逆境胁迫带来的伤害。SOD是清除体内的O2.-的主要酶类它可以将植物体内的O2.-歧化成H2O2和O2，从而减轻O2.-对植物造成的氧化胁迫；POD、CAT和APX（主要位于叶绿体中）均可将H2O2降解产物为H2O2和O2，避免H2O2的蓄积对细胞膜产生伤害［17］。与对照比，Cu2+显著处理降低了水稻叶SOD（图5A）和POD（图5B）的活性，降幅分别达51.66%和41.09%，而Cu2+处理且外施SNP后，两者活性与对照比均无显著差异。与对照相比，Cu2+处理并没有显著改变水稻叶APX（图5C）和CAT（图5D）活性，但外施SNP则显著提高了APX和CAT的活性，这与H2O2组织染色结果相吻合。

图5　外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗叶中SOD（A）、POD（B）、APX（C）和CAT（D）活性的影响Fig.5 Effect of exogenous NO on activities o f SOD（A），POD（B），APX（C）and CAT（D）in leaves of rice seed lings under Cu2+stress

2.6外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗叶绿素和叶片可溶性蛋白质含量的影响

叶绿素是绿色植物光合作用的物质基础，叶绿素含量的高低反映叶片生理活性变化的重要指标［18］。与对照相比，Cu2+处理的水稻幼苗相对叶绿素含量降低了39.32%，差异显著，这与肉眼观察Cu2+处理叶片颜色泛黄相一致；Cu2+处理且外施SNP后，与Cu2+处理相对，相对叶绿素含量显著升高，值与对照无显著性差异（图6A）。植物体内的可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，受到逆境胁迫，它们会发生一定的变化，测定其含量是了解植物抗逆性的一个重要指标［19］。Cu2+胁迫下水稻幼苗叶片中蛋白质含量显著下降，仅为对照的86.57%，二者差异显著，外源添加SNP后，可溶性蛋白质含量均高于Cu2+胁迫处理，差异达显著水平，表明外源SNP提高了水稻幼苗适应胁迫的能力。

图6　外源NO对Cu2+胁迫下水稻幼苗叶中叶绿素（A）和可溶性蛋白质（B）含量的影响Fig.6 Effec t of exogenous NO on con tent of soluble proteins in leaves of rice seed lings under Cu2+stress

3　结论

30μmol·L-1的CuCl2提高了水稻叶中H2O2和O2.-的含量，使幼苗遭受到严重的氧化胁迫，并且并导致MDA含量和相对电导率显著提高，叶绿素含量和可溶性蛋白质含量均显著下降，因而显著降低了水稻幼苗的株高、根长、根数和鲜重；外源添加50μmol·L-1SNP后，水稻叶中H2O2和O2.-的含量明显下降，MDA含量和相对电导率显著降低，叶中SOD、POD、APX和CAT活性，以及叶绿素含量和可溶性蛋白质含量均显著升高，CuCl2处理的幼苗株高、根长等较Cu2+处理显著提高。结果表明，外源施加硝普钠通过提高叶片抗氧化酶活性，降低氧化胁迫缓解水稻幼苗Cu的毒害。

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（责任编辑：耿继祥）

Effects of Sodium Nitroprusside On A lleviating the Toxicity of Copper in Rice Seed lings

YE Weidong1，LI Sainan1，BAO Ruodong1，MAO Qisheng1，YING Haoze1，DU Zhaokui*1，2，3
（1.School of Life Sciences，Taizhou University，Taizhou 318000，China；2．Zhejiang Provincial Key Laborato ry of Plant Evolutionary Ecology and Conservation，Taizhou 318000，China；3．Institu te of Ecology，Taizhou University，Taizhou 318000，China）

In order to investigate the effects o f sodium nitroprusside（SNP） in relieving heavy metal stress，the grow th and antioxidative indexes of seedlings under copper stress were studied by w ater culture experiment w ith rice"Suxiu 9"as the specimen.The results shows that 30μmol·L-1CuCl2treatment significantly reduced the height，root length，root number and fresh w eight of rice seedlings，and enhanced the content o f H2O2and O2.-in leaves，so the seed lings suffered severe oxidative stress，resulting in a significant increase o f MDA and relative conductivity.Moreover，SOD activity，POD activity，chlorophyll and so luble protein content in leaves decreased significantly as w ell.However，when exogenously 50μmol·L-1SNP w ere added to 30μmol·L-1CuCl2，the plant height，the root length of rice，compared w ith Cu2+treatment，obviously increased，w hile H2O2and O2.-content in leaves decreased significantly，MDA conten t and relative conductivity significantly reduced，and SOD activity，POD activity，APX activity，CAT activity，chlorophy ll and soluble protein content in leaves w ere significantly increased.The results shows that:p roper SNP concentration can increase antioxidant enzyme activity in rice leaves，reduce the amount of ROS，and alleviate leaf membrane lipid peroxidation，hence，resisting the toxic effects of heavy metal Cu2+better.

Rice；Heavy metal；Nitric oxide；Antioxidative enzymes

10.13853/j.cnk i.issn.1672-3708.2015.03.006

2014-11-09；

2014-12-22

简介：杜照奎（1979-），男，湖北随州人，讲师，博士，主要从事植物分子生态学研究。