SUMO-2/3活化介导丹参对缺血神经元的保护机制*

王慧钢，于思淼，邱　瑾，刘振林

（1天津市滨海新区大港小王庄镇社区卫生服务中心，天津300273；2天津中医药大学，天津300193；3天津安捷临奥脑科医院神经外科，天津300402）

·实验研究·

SUMO-2/3活化介导丹参对缺血神经元的保护机制*

王慧钢1，于思淼2，邱瑾3，刘振林3

（1天津市滨海新区大港小王庄镇社区卫生服务中心，天津300273；2天津中医药大学，天津300193；3天津安捷临奥脑科医院神经外科，天津300402）

［目的］从类泛素化（SUMO）角度研究丹参对缺血性脑血管病后的神经元保护机制。［方法］原代分离培养SD大鼠海马神经元细胞，免疫荧光方法予以鉴定；制作神经元体外氧糖剥夺（OGD）模型，分为对照组、OGD组和丹参治疗组；酶联免疫吸附（ELISA）法检测乳酸脱氢酶（LDH）含量，原位凋亡法检测凋亡细胞率；蛋白印记和免疫荧光方法检测SUMO-1和SUMO-2/3在细胞内的表达定量和定位情况。［结果］所培养细胞高表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）和微管相关蛋白-2（MAP-2），胶质纤维酸性蛋白（GFAP），神经元纯度大于95%；ELISA结果显示，3组中LDH含量对照组＜丹参治疗组＜OGD组；凋亡细胞率对照组＜丹参治疗组＜OGD组；蛋白印记结果显示，神经元接受OGD处理后SUMO-2/3的蛋白表达量明显上升（P＜0.05），但SUMO-1无明显变化（P＞0.05），而丹参治疗能够进一步提高SUMO-2/3的表达（P＜0.05）；免疫荧光结果显示OGD神经元发生了SUMO-2/3由细胞浆向细胞核的明显移位现象，而丹参治疗能够进一步增强这种效果。［结论］丹参能够通过诱导SUMO-2/3，而非SUMO-1的活化机制，发挥对缺血神经元的保护作用。

缺血性脑血管病；小类泛素蛋白；丹参；神经元

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.10

脑卒中是严重危害人类生命健康的神经系统疾病之一［1］。丹参能够通过扩张心脑血管，减少氧自由基生成，保护内皮细胞等机制改善脑卒中后的氧化应激反应，增加神经保护作用［2］。新近研究发现，一种类泛素蛋白（SUMO）在脑缺血发生后可被显著激活，并对神经元具有肯定的保护作用［3］。但到目前为止，尚未见到有关于中药丹参对卒中后SUMO通路调控的报道。本研究旨在通过观察丹参对体外培养的氧糖剥夺（OGD）神经元中3个最主要的SUMO家族成员SUMO-1～3的表达调控，推测SUMO通路是否介导了丹参对缺血神经元的保护作用机制，为未来基于SUMO这类小分子蛋白物质的中成药物开发提供有价值的参考和借鉴。

1　资料与方法

1.1试剂与动物10mL装丹参注射液（杭州正大青春宝药业公司）；改良Eagle培养基（DMEM，美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青）；乳酸脱氢酶（LDH）酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（武汉博士德）；原位凋亡检测试剂盒（北京百浩）；兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白（MAP-2）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）均购自北京中杉公司，兔抗大鼠SUMO-1和SUMO-2/3（北京中原领先）；孕龄18 d SD大鼠4只购自中国军事医学科学院，饲养于中国协和医科大学血液病研究所实验动物中心，无菌，温度20～25℃，湿度（50±5）%。

1.2神经元原代培养将SD大鼠脱颈处死，75%乙醇消毒5min，在超净台上取出全脑，小心剥离并去除脑膜及脉络丛，分离双侧海马，剪成约1mm3的小块，在孵箱中以0.25%胰蛋白酶消化5min。以1.0×106密度接种细胞到经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿中，37℃、5%二氧化碳（CO2）、饱和湿度条件下培养。6～8 h细胞贴壁后，换培养基为含2% B27的Neurobasal，含有B27和0.5mmol/L的谷氨酰胺。培养2～3 d培养基中加入8～10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非神经细胞和原代胶质增殖。每3天用Neuronbasal使用液半量换液。

1.3免疫荧光方法鉴定将培养第8天的细胞用4%多聚甲醛室温固定30min，1%Triton X-100室温处理10min，10%羊血清封闭30min，甩去血清，滴加不同稀释度的MAP-2（1∶500）、GFAP（1∶500）、NSE（1∶500）抗体，置湿盒中4℃过夜，空白对照以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗；转日滴加适当比例稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）或四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记二抗，置湿盒中37℃孵育45min；封片剂封片，荧光显微镜下观察。

1.4神经元OGD模型的建立取培养第8天后的神经元进行后续实验。共分为以下3组：1）对照组：单纯海马神经元，不进行其他干预处理。2）OGD组：细胞置于OGD液中处理4 h，然后吸去OGD液，PBS洗涤，加入标准DMEM高糖培养液继续培养20 h。3）以含200mg/L丹参注射液的OGD液取代单纯OGD液，其他步骤同2）。

1.5 LDH活力检测上述分组细胞在培养箱中继续培养24 h后按照ELISA说明书对条件培养液进行LDH含量检测。

1.6细胞原位凋亡检测将继续培养24 h后的细胞于4%中性甲醛固定10min，3%过氧化氢甲醇中浸洗10min，用蛋白酶K孵育15min，PBS洗涤后加入50μL的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60min，4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）复染，封片及镜下观察。计算细胞凋亡率（细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%）。

1.7 Western blot方法提取细胞总蛋白，电泳及转膜后脱脂奶粉封闭1 h，滴加相应一抗，抗体稀释度为SUMO-1（1∶2 000）、SUMO-2/3（1∶2 000）和βactin（1∶500），4℃水平摇床孵育过夜，次日使用辣根酶标记的1∶500稀释二抗孵育2 h。凝胶成像系统扫描光密度值，Quantity One软件进行定量分析。

1.8细胞免疫荧光方法方法同1.3，抗体稀释度为SUMO-1（1∶1 000）和SUMO-2/3（1∶1 000）。

1.9统计学方法应用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析进行组间比较，组间两两比较采用Dunnett’sT3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1神经元鉴定结果见图1，TRITC荧光标记显示为红色细胞浆着色，FITC荧光标记显示为绿色细胞浆着色。可见所培养的细胞高表达神经元特异标记蛋白NSE，其阳性表达率为（96.47±3.45）%和MAP-2，其阳性表达率为（96.22±3.21）%，几乎不表达胶质细胞标记蛋白GFAP，其阳性表达率为（0.79±0.27）%，同时综合上述鉴定结果，可见所培养的神经元细胞纯度较高，即大于95%，符合后续实验要求。

2.2 LDH浓度和细胞凋亡率测定结果由ELISA实验结果可以看出，对照组中未经任何处理的神经元LDH水平非常低，在OGD组神经元LDH的水平明显增高（P＜0.01），丹参治疗组LDH水平则明显低于OGD组（P＜0.05）；细胞凋亡实验结果显示了相似的趋势，见表1、图2。

图1　神经细胞标志蛋白荧光检测Fig.1 The expression of neural cell m arker proteins detected by fluorescenceassay

表1　不同组别乳酸脱氢酶浓度及细胞凋亡率比较（x±s）Tab.1 Com parison of lactate dehyd rogenase concentration and the rateof cellapoptosisamong differentgroups（x±s）

图2　 TUNEL方法检测细胞凋亡情况Fig.2 Cellapoptosisdetected by TUNEL assay

2.3 Western blot结果由结果可以看出游离及共价结合状态的SUMO-1蛋白表达水平在3组间没有明显变化（F=0.978，P＞0.05），游离状态的SUMO-2/3在3组间比较没有统计学差异（F=1.237，P＞0.05）但共价结合状态的SUMO-2/3在3组间比较有统计学差异（F=11.417，P＜0.05），见图3。

2.4免疫荧光结果SUMO-1蛋白在3组中均定位于细胞浆，3组间无明显变化；SUMO-2/3在对照组主要表达于细胞浆，接受OGD处理后SUMO-2/3发生了明显向细胞核的转移，在丹参治疗组这种趋势进一步加剧，见图4。

图3　 W estern blot检测SUMO蛋白表达水平Fig.3 Expression of SUMO detected by W estern blotassay

图4　 SUMO成员在不同组中的表达定位荧光检测Fig.4 Expression and localization of SUMO members in the differentgroups detected by fluorescenceassay

3　讨论

脑卒中是一种突发的脑血液循环障碍性疾病，是指因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄，闭塞或破裂，而造成急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征［4-6］。主要包括脑梗死、脑出血等疾病，其原因可由动脉粥样硬化加重致血管过度狭窄、栓子脱落、动脉瘤破裂或颅内肿瘤内灶性出血等引起［7-9］。当前临床治疗主要以外科手术及血管内介入治疗为主，但这些治疗均需要在发病短时间内接受治疗，且治疗后期的神经功能恢复大多并不理想，而对于偏远地区的脑卒中患者受医疗条件的限制，使死亡和致瘫风险倍增［10-13］。因此有必要进一步认识脑卒中的病情演进机制，并寻找新的有效的救治性药物。

SUMO是一类结构与泛素蛋白相似，但功能迥异的蛋白质翻译后修饰小分子蛋白［14-15］。与泛素蛋白降解靶蛋白机制不同，SUMO常常与泛素竞争靶蛋白结合位点，抑制蛋白遭到由泛素介导的蛋白酶的降解，故而多对靶蛋白起到一定的保护作用［16-18］。有研究表明，脑组织急性缺血缺氧发生后，会诱发SUMO循环通路的快速激活和反应，特别是使原本存在于细胞浆中游离状态的SUMO-2/3快速与大量靶蛋白结合，使部分蛋白质免于泛素介导的蛋白酶降解，同时启动细胞核做出积极的反应，诱导产生新的神经保护性蛋白，发挥神经损伤修复作用［19］。

基于上述理论，笔者首次对传统血管保护性中药丹参进行实验研究，旨在从类泛素化角度研究丹参对缺血性脑血管病后的神经元保护机制。首先使用原代分离培养法获得了高纯度的SD大鼠海马神经元细胞，以其为研究对象，制作了神经元OGD模型，并给予丹参治疗。LDH属糖酵解酶，LDH测定常用于诊断心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤，其含量的显著增高常反应病情的严重程度［20］。在体外实验中，常被用来检测所培养细胞的受损害程度。本研究的结果显示，在所检测的3组中LDH含量对照组＜丹参治疗组＜OGD组，提示丹参治疗组的神经元受损程度明显低于OGD组，这种趋势在原位凋亡实验中得到相同的验证。这均反应丹参作为一种血管保护性药物对于因缺血所致的神经元损伤具有肯定的神经保护作用。

为进一步研究其内在机制，笔者利用蛋白印记方法对SUMO1-3的蛋白表达水平和蛋白定位进行研究。本研究结果显示，神经元接受OGD处理后SUMO-2/3的蛋白表达量明显上升，但SUMO-1无明显变化，而丹参治疗能够进一步提高SUMO-2/3的表达；免疫荧光结果显示OGD神经元发生了SUMO-2/3由细胞浆向细胞核的明显移位现象，而丹参治疗能够进一步增强这种效果。由此得出结论，丹参能够通过活化SUMO-2/3，而非SUMO-1的机制，发挥对缺血神经元的保护作用。

总之，通过本实验笔者首次报道传统中药丹参可以通过激活SUMO循环通路途径，诱导多个靶蛋白的SUMO化作用，对受损神经元发挥神经保护作用。这一结论丰富了丹参对于脑卒中的神经保护机制理论，为新型小分子药物的研发提供了新的参考。参考文献：

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（本文编辑：马英，滕晓东）

Theactivation of SUMO-2/3mediated protection effectsof Salviam iltiorrhiza on ischem ic neurons

WANGHui-gang，YU Si-m iao，QIU Jin，LIU Zhen-lin
（1.Xiaowangzhuang Community Health Service Center，Dagang District，BinhaiNew Areaof Tianjin，Integrated TraditionalChineseand Western Medicine，Tianjin 300273，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Neurosurgenry Department，Tianjin Anjie LinaoBrain Hospital，Tianjin 300402，China）

［Objective］To study the protectionmechanism of salviamiltiorrhiza on neuronsafter ischem ic cerebral vascular disease from the field ofsmallubiquitin-like protein（SUMOs）.［M ethods］The neuronswere cultured from the hippocampalof SD rats，and identified by fluorescence immunoassaymethod.Aftermaking oxygenglucose deprivation（OGD）model for neurons，we designed threegroups for thisstudy:controlgroup，OGDgroup and salviamiltiorrhizagroup.The lactate dehydrogenase（LDH）contentwasdetected by ELISA，and apoptosisby apoptosis in situ.Then the quantitative expression and intracellular localization of SUMO-1and SUMO-2/3 proteinswere detected bywestern blotand immunofluorescencemethod.［Results］The cultured cellswerewith high expression ofneuron specific enolase（NSE）and microtubule associated protein-2（MAP-2），but low levelofglial fibrillary acidic protein（GFAP），the neuron puritygreater than 95%.ELISA results showed that the contentof LDH in the threegroupswere controlgroup＜Salviamiltiorrhizagroup＜OGDgroup，as well as the results from apoptosis.Western blotting results showed that the level of SUMO-2/3 of neurons received OGD treatmentwas raised significantly（P＜0.05），buttherewasno significantchange in SUMO-1（P＞0.05），and salviamiltiorrhiza treatmentcan further improve the expression ofSUMO-2/3（P＜0.05）.Immunohistochemistry resultsshowed that therewasapparentshiftof SUMO-2/3 from cytoplasm to nucleus in OGD neurons，and salviamiltiorrhiza treatment could further enhance this effect.［Conclusion］Salviamiltiorrhiza can induce SUMO-2/3 activation and enhance protecteffectson ischemic neurons.

ischemic cerebrovascular disease；smallubiquitin like protein；Salviamiltiorrhiza；neuron

R743

A

1672-1519（2015）07-0420-04

国家自然科学基金项目（81471175）。

王慧钢（1973-），男，主治医师，主要从事内科系统疾病的中西医结合治疗。

刘振林，E-mail：wjzhenlin817@163.com

（2015-01-28）