响应面法优化川党参多糖的提取工艺研究*

武新亮，王宏军，白子霞，龙元桃（.天津市宝坻区人民医院药剂科，天津30800；.辽宁医学院，锦州00）

响应面法优化川党参多糖的提取工艺研究*

武新亮1，王宏军2，白子霞1，龙元桃2
（1.天津市宝坻区人民医院药剂科，天津301800；2.辽宁医学院，锦州121001）

［目的］采用响应面法（RSM）优化川党参中多糖的提取工艺。［方法］在单因素实验基础上，以提取温度、提取次数、提取时间3个因素为自变量，多糖提取率为响应值，采用三因素三水平的响应面分析各因素对响应值的影响。［结果］多糖的最佳工艺条件为提取温度80℃，提取次数5次，提取时间5 h，多糖实际提取率可达22.31%。［结论］应用响应面法优选出的提取工艺稳定、合理、可行。

川党参；多糖；响应面法；提取工艺

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.13

川党参为桔梗科植物川党参（Codonopsis tangshen Oliv.）的干燥根，主产于四川、贵州、湖南等地，为中药党参的来源之一，具有补中益气，生津，养血等功效，主要用于治疗脾胃虚弱，气血两亏，体倦无力等［1］，可与多种药物配伍使用治疗女子癥瘕［2］、眩晕［3］、充血性心力衰竭［4］等疾病。现代研究表明，其中主要含有多糖、酚类、甾醇、挥发油及生物碱等多种成分［5］，其中多糖具有明显的免疫促进功能［6］，清除氧自由基［7］，抗肿瘤［8］，降血糖［9］等多种活性。

响应面法（RSM）是采用多元二次回归方法作为函数估计的方法，将多因子实验中因子与指标的相互关系用多项式拟合，依此可对函数的响应面和等值线进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系［10］。与以往采用的正交设计法不同，在实验设计与表述结果方面更加优良，目前已广泛应用到提取工艺的优化中［11-14］，因此，选用响应面法优化川党参中多糖的提取工艺，为川党参多糖的进一步研究提供理论基础。

1　材料与仪器

1.1材料川党参采自于四川成都，经沈阳药科大学李玉山教授鉴定为川党参（Codonopsis tangshen Oliv.）的根。无水乙醇、氯仿、葡萄糖、蒽酮、硫酸、甲醇均为国产分析纯。

1.2仪器KDM型可调控温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司），UV757CRT型紫外可见分光

光度计（上海精密科学仪器有限公司），DZKW-4型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），RE-5203型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

2　方法

2.1多糖的提取川党参干燥，粉碎，过60目筛。称取粉末50g，加入氯仿甲醇、80%乙醇依次进行处理后，残渣干燥，精确称质量，每份1g，蒸馏水煎煮提取。滤液浓缩加无水乙醇使醇浓度达到80%，冷藏，静置，过滤，滤液残渣烘干，溶解，定容［15-16］。

2.2蒽酮—硫酸溶液的制备［17］精密称取蒽酮0.33g，溶于100 mL浓硫酸中，置棕色试剂瓶中备用。

2.3标准溶液的制备及测定精密称取葡萄糖100mg，加蒸馏水溶解定容至100mL，再稀释至0.05g/L。精密吸取标准品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL分置10mL具塞试管中，加蒸馏水补足至1mL，加入蒽酮—硫酸溶液2mL，冰浴中冷却，再置水浴锅中加热10min，冷却，于625 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，以吸光度（Ai）对样品浓度（Ci）作回归分析，得到回归方程，Ai=18.433 9 Ci-0.014 5，r=0.999 8，糖含量在0～0.05g/L范围内具有良好的线性关系。

2.4多糖含量与提取率的测定取待测品，溶于5mL蒸馏水中，稀释1 000倍，分别精密吸取0.4、0.8mL置10mL具塞试管中，加蒸馏水补足至1mL，按标准溶液的方法进行测定，多糖提取率公式如下。

2.5单因素实验以多糖提取率为指标，分别选取提取温度、料液比、提取次数、提取时间为考察因素［18］，进行单因素实验。

2.6响应面实验设计在单因素实验基础上，根据中心组合实验设计（Box-Benhnken）原理，利用Design-Expert 7.13软件进行响应面的拟合与分析。选取提取温度（A）、提取次数（B）、提取时间（C）3个因素，采用三因素三水平的响应面法进行实验设计。

表1　中心组合实验设计因素水平表Tab.1 Box-Benhnden factorsand levels

3　结果与讨论

3.1单因素实验

3.1.1提取温度对多糖提取率的影响在85℃以前，随着提取温度的升高，多糖提取率呈现上升趋势，且变化较为显著，由于温度的升高可以加速分子热运动，导致多糖的提取率上升；在85℃以后，随着提取温度的增高稍有下降，这可能是随着温度的进一步升高多糖结构被破坏的缘故。由此可选择提取温度80～90℃较为适宜。见图1。

图1　提取温度对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extracting tem perature on the yield of polysaccharide

3.1.2料液比对多糖提取率的影响根据结果绘制曲线，随着比例的逐渐增大，多糖提取率逐渐上升，料液比的增大可以使分子有足够的热运动空间，从而促进多糖充分的溶解释放。但增大到一定程度后，多糖的提取率变化很小，因此料液比选择为1∶25。见图2。

图2　料液比对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of solid/solvent ratio on the yield of polysaccharide

3.1.3提取次数对多糖提取率的影响由于足够的提取次数，每次加入的溶剂可以为多糖分子提供了较大的浓度梯度，有利于多糖分子的扩散，提取率逐渐增加，但增加到一定的次数的时候，提取率基本不再变化，确定提取次数4～6次为宜。见图3。

图3　提取次数对提取率的影响Fig.3 Effectof extracting timeson the yield of polysaccharide

3.1.4提取时间对多糖提取率的影响随着提取时间的增加，多糖分子具有充足的时间在溶剂中溶解扩散，从而使多糖提取率显著增加，但增大到一定时间以后多糖提取率几乎保持不变。考虑提取成本和费时的原因，所以提取时间选择4～6 h间为宜。见图4。

图4　提取时间对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extracting time on the yield of polysaccharide

3.2响应面实验

3.2.1实验结果与模型的建立提取温度（A）、提取次数（B）、提取时间（C）的优化实验结果见表2。共15个实验点，其中12个为析因点，3个为零点，析因点为自变量取值A、B、C所构成的三维顶点，零点为区域的中心点。其中零点实验重复3次，用以估算实验误差。利用Design-Expert7.13软件对响应值与各因素进行回归拟合，对实验数据进行多元回归拟合，得到的二次多项回归模型为：Y=24.766 7+ 0.456 3A+0.673 8B+0.635C-0.13A B-0.342 5AC-0.032 5BC-0.628 3A2-1.188 3B2-1.560 8C2。

表2　响应面实验设计及数据结果Tab.2 RSM experimental design and response value of the extraction technology

3.2.2回归分析利用Design-Expert7.1.3软件分析功能对回归模型和回归模型系数分别进行显著性分析，结果见表3、表4。

表3　回归模型的方差分析Tab.3 Analysisofvariance to the regressionmodel

从表3可知，整体模型的P值为0.0411（P＜0.05），表明该二次方程模型显著；模型的失拟项的P值为0.206 4（P＞0.05），说明模型选择适宜；并且该模型总回归系数R2=0.9045，说明该模型与实际试验拟合较好，可以用于川党参多糖提取实验的理论预测。

表4　回归模型系数的方差分析Tab.4 Analysisof variance to themodelcoefficients

由表4方差分析结果可知，该模型的一次项提取次数（B）和提取时间（C）对多糖提取率有显著影响（P＜0.05），其余不显著；二次项提取时间（C）达到高度显著水平（P＜0.01），提取次数（B）具有显著影响（P＜0.05），表明各个影响因素与响应值不是线性关系。

3.2.3因素间交互影响分析为了进一步研究相关变量之间的交互作用，利用响应面图与等高线图来进行可视化的分析，等高线图上的值与响应面上的点一一对应，可以清晰的反映提取温度、提取次数、提取时间对多糖提取率的影响。各因素处于不同实验水平时，对响应值的影响呈现出不同的变化规律，响应曲面呈现不同程度的扭曲。图5-7显示，各响应面扭曲程度很小，等高线图形近似于圆形，各交互作用均不显著，这与回归分析的结果一致（P值分别为0.724 4、0.370 8和0.929 3）。综合各响应面分析发现，各因素对响应值作用的显著性由高到低为B＞C＞A（P值分别为0.0411、0.0496和0.1233）。

3.2.4最佳提取工艺条件的确定结合数据模型分析得到提取温度80℃，提取次数为4.62次，提取时间4.87 h，但考虑到实际操作的便利，将最佳提取条件工艺修正为提取温度80℃，提取次数5次，提取时间5 h，在此修正条件下，进行平行实验，实际测得一次提取率为22.31%，回归模型预测提取率理论值可达22.84%，实际测定值比理论预测值低0.53%。因此回归方程能较好地预测理论提取率。

图5　提取温度与提取次数对多糖提取率影响的响应面图Fig.5 Responsesurfacegraph showing theeffectof extracting temperatureand extracting timeson the yield ofpolysaccharide

图6　提取温度与提取时间对多糖提取率影响的响应面图Fig.6 Response su rfacegraph show ing the effect of extracting tem perature and extracting tim e on the yield of polysaccharide

图7　提取时间与提取次数对多糖得率影响的响应面图Fig.7 Response su rfacegraph show ing the effect of extracting tim e and extracting timeson the yield of polysaccharide

4　结论

本次实验通过单因素实验考察了工艺因素对川党参中多糖提取率的影响，发现提取温度、提取次数、提取时间对多糖提取过程影响最为显著。通过响应面法建立关键因素对多糖提取率的二次多项数学关系模型［19］，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了工艺因素，探讨了个因素间的交互作用。利用软件分析结合实际情况得知提取温度为80℃，提取次数为5次，提取时间为5 h时多糖提取率最高，实际测得提取率为22.31%，回归模型预测提取率理论值可达22.84%。实际测定值比理论预测值低0.53%。因此回归方程能较好地预测理论提取率。本实验优选出的提取条件，对今后川党参中多糖的进一步提取研究具有一定的指导作用。

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（本文编辑：高杉，滕晓东）

Op tim ization of theextraction techniqueof Codonopsis tangshen Dliv.polysaccharideusing response surfacemethodoloy

WU Xin-liang1，WANGHong-jun2，BAIZi-xia1，LONGYuan-tao2
（1.Departmentof Pharmacy，Tianjin BaodiHospital，Tianjin 301800，China；2，LiaoningMedicalUniversity，Jinzhou 121001，China）

［Objective］To optimize the extraction conditions of polysaccharide in Codonopsis tangshen Oliv.using response surface methodology（RSM）.［M ethods］On thebasisofsingle factor test，extracting temperature，extracting timesand extracting timewere selected as response factors；the yield of polysaccharide wasused as response value.A three-factor-three-levelexperimentdesign was developed.RSM wasemployed to analyze the resultsof experiments.［Results］The optimum extraction conditionsofpolysaccharidewere as follows:extracting temperature was 80℃，extracting times was 5 times，and extracting time was 5 h.The yield of polysaccharide was 22.31%.［Conclusion］RSM employed in optimization of theextraction conditions is feasible.

Codonopsis tangshen Oliv.；polysaccharide；RSM；extraction technique

R284.2

A

1672-1519（2015）07-0432-05

国家自然科学基金项目（31201951）；辽宁省优秀人才项目（LJQ2013087）。

武新亮（1980-），男，硕士，主要研究方向为中药有效成分研究。

王宏军，E-mail：lnwhj2012@163.com。

（2015-02-03）